Incorporamento di sferoidi 3D in gocce di gel di agarosio: una tecnica per conservare gli sferoidi per l'analisi a valle

In questo articolo

Abstract

Fonte: Rolver, M. G. et al. Valutazione della vitalità e della morte cellulare in colture sferoidi 3D di cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive la tecnica per incorporare sferoidi 3D in gocce di gel di agarosio per la conservazione. Gli sferoidi 3D incorporati possono essere ulteriormente utilizzati per l'analisi a valle.

Protocollo

1. Incorporamento di sferoidi 3D

Preparare il gel di agarosio in cui sono incorporati gli sferoidi (necessario solo la prima volta che si esegue il protocollo)
1. Mescolare 1 g di bacto-agar in 50 mL di ddH₂O.
2. Scaldare lentamente nel forno a microonde fino a quando il bacto-agar non si sarà sciolto e si sarà formato un gel omogeneo. Non lasciare bollire il gel.
3. Mantenere il bacto-agar caldo a bagnomaria a 60 °C.
4. Mantenere a 4 °C tra un esperimento e l'altro.
Inclusione di sferoidi
1. Il giorno 1, per ogni condizione, riunire un minimo di 12 sferoidi in una provetta da 1,5 mL.
2. Lavare una volta con 1 ml di 1X PBS ghiacciato.
3. Per fissare gli sferoidi, aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4%.
  nota: La manipolazione della paraformaldeide deve essere eseguita in una cappa aspirante.
4. Lasciarli incubare per 24 ore a RT.
5. Il giorno 2, scaldare accuratamente il gel di agarosio mettendolo in un becher pieno d'acqua in un forno a microonde. Assicurarsi che il gel non bolle. Tenere in caldo su una piastra riscaldante da banco, a 60 °C fino al momento dell'uso.
6. Lavare gli sferoidi due volte con 1 mL di 1X PBS ghiacciato.
7. Aspirare la maggior parte del 1X PBS (lasciare circa 100 μl a questo punto è pratico per maneggiare gli sferoidi).
8. Preparare una pipetta da 20 μl tagliando il puntale della pipetta con un'inclinazione per ottenere un puntale più appuntito con un foro più grande (Figura 1).
  NOTA: La parte successiva deve essere eseguita rapidamente per garantire un trasferimento ottimale degli sferoidi ed evitare la solidificazione della goccia di gel. Se non è disponibile alcun blocco riscaldante, si consiglia di catturare prima gli sferoidi e poi far cadere l'agarosio (cioè invertendo l'ordine dei punti 1.2.9 e 1.2.10).
9. Fare una goccia di gel di agarosio su un vetrino da microscopio. Posizionare il vetrino su un blocco riscaldante caldo per evitare che l'agarosio si solidifichi.
10. Utilizzando il puntale della pipetta modificato (passaggio 1.2.8), prelevare il maggior numero possibile di sferoidi in un volume di 15-20 μl.
11. Iniettare con cautela 15-20 μL di 1X PBS contenente sferoidi al centro della goccia di gel di agarosio senza toccare il vetrino del microscopio.
  nota: Questo è un punto un po' difficile. Gli sferoidi andranno persi se la punta della pipetta tocca il vetrino del microscopio durante l'iniezione degli sferoidi nella goccia di gel. Si consiglia di praticare l'intero processo di produzione della goccia di agarosio e di iniettare gli sferoidi iniettando un liquido colorato nella goccia. Ciò consentirà la visualizzazione di una potenziale penetrazione attraverso la goccia, poiché il liquido colorato fuoriuscirà sul vetrino.
12. Lasciare indurire la goccia di gel di agarosio incubando per 5-10 minuti a RT o a 4 °C. Una volta che la goccia di gel si è un po' solidificata (ma è ancora piuttosto morbida), spingere con cautela la goccia di gel dal vetrino del microscopio in una cassetta di plastica con un bisturi.
13. Coprire le cassette di plastica con etanolo al 70%.
  nota: A questo punto, gli sferoidi possono essere utilizzati direttamente o conservati per mesi.
14. Incorporare lo sferoide incluso nell'agarosio nella paraffina, sezionarlo in vetrini di 2-3 μm di spessore e colorare con ematossilina ed eosina o sottoporlo a colorazione immunoistologica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

figure-results-1
Figura 1: Fissaggio, inclusione e analisi immunoistochimica degli sferoidi. (A) Rappresentazione schematica del protocollo per l'inclusione degli sferoidi. I singoli passaggi sono contrassegnati come (i-vii). (B) Immagine dello sferoide MDA-MB-231 incorporato. Barra della scala: 50 μm. (C) Immagine rappresentativa dello s...