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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Preparazione della matrice extracellulare della lingua (TEM)
- Giustiziare i topi per lussazione cervicale e rimuovere le lingue usando forbici e pinzette chirurgiche sterili.
- Immergere le lingue in etanolo al 75% per 3 minuti, quindi mettere ciascuna lingua in una provetta Eppendorf (EP) da 1,5 mL con 1 mL di soluzione sterile tamponata con fosfato (PBS) da 10 mM.
nota: La concentrazione di PBS in tutte le fasi successive è la stessa della concentrazione in questa fase.
- Lisi cellulare mediante congelamento-scongelamento: congelare le lingue in provette EP a -80 °C per 1 ora e poi scongelare le lingue a temperatura ambiente per 45 minuti per 3 cicli.
- Caricare ogni lingua su un pezzo di sutura chirurgica usando un ago chirurgico e avvolgere l'estremità della sutura con un pezzetto di carta stagnola sterile. Eseguire l'operazione in una piastra di coltura da 3,5 cm o 6 cm contenente il 75% di etanolo in condizioni sterili.
nota: La lunghezza appropriata di ogni pezzo di sutura chirurgica è di circa 20 cm e la dimensione appropriata di ogni pezzo di carta stagnola è di circa 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). La lingua deve essere caricata vicino alla carta stagnola.
- Sciacquare ogni lingua con 3 ml di PBS sterile in una piastra di coltura da 3,5 cm o 6 cm per 30 s. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Lavare la lingua con acqua ultrapura: aggiungere l'ampicillina in un flacone a bocca larga con 250 ml di acqua ultrapura sterile fino a una concentrazione finale di 90 μg/mL. Mettere le lingue nella bottiglia contenente una barra di agitazione. Stringere il tappo del flacone con parte della sutura rimasta all'esterno del flacone. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
nota: È possibile inserire fino a 5 lingue nello stesso flacone in considerazione dell'attorcigliamento della sutura. La carta stagnola si trova all'estremità della sutura nel flacone per evitare che la lingua scivoli via. Le linguette devono essere posizionate a 2 cm di altezza dal fondo del flacone regolando la lunghezza della sutura rimasta all'interno del flacone. Questa nota è valida anche per i passaggi 1.8, 1.10, 1.12 e 1.16.
- Mettere il flacone su un agitatore magnetico per 12 ore.
- Lavare la lingua con NaCl: aggiungere ampicillina in un flacone a bocca larga con 250 ml di NaCl sterile 1 M a una concentrazione finale di 90 μg/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo del flacone con parte della sutura rimasta all'esterno del flacone. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere il flacone su un agitatore magnetico per 24 ore.
- Lisi cellulare con Triton X-100: aggiungere ampicillina a una concentrazione finale di 90 μg/mL in un flacone a bocca larga con 250 mL di Triton X-100 sterile al 2% in PBS. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo del flacone con parte della sutura rimasta all'esterno del flacone. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere il flacone su un agitatore magnetico per 48 ore.
- Lavare la lingua con CaCl2/MgCl2: aggiungere ampicillina in un flacone a bocca larga con 250 mL di 5 mM di CaCl2/MgCl2 sterile a una concentrazione finale di 90 μg/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo del flacone con parte della sutura rimasta all'esterno del flacone. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere il flacone su un agitatore magnetico per 24 ore.
- Digestione per DNasi: aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a ciascuna provetta EP. Aggiungere DNasi in HBSS rispettivamente a una concentrazione finale di 300 μM. Spostare ciascuna lingua in ciascun tubo EP, con parte della sutura all'esterno del tubo. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
nota: Assicurarsi che la parte della sutura che rimane all'interno dei flaconi nei passaggi precedenti rimanga anche all'interno del tubo EP in questo passaggio e assicurarsi che la parte della sutura che rimane all'esterno dei flaconi nei passaggi precedenti rimanga anche all'esterno del tubo EP in questo passaggio.
- Incubare le lingue in provette EP a 37 °C per 24 ore.
- Lavare la lingua con PBS: aggiungere ampicillina in un flacone a bocca larga con 250 ml di PBS sterile a una concentrazione finale di 90 μg/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo del flacone con parte della sutura rimasta all'esterno del flacone. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere il flacone su un agitatore magnetico per 24 ore.
- Conservare il TEM preparato in PBS sterile a 4 °C fino al momento dell'uso.