Criomacinazione di tessuto decellularizzato: una tecnica per ottenere polvere di matrice extracellulare fine

Abstract

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabbricazione di schiume e microvettori derivati da matrice extracellulare come piattaforme di coltura e somministrazione cellulare tessuto-specifiche. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, presentiamo il protocollo per ottenere polvere di matrice extracellulare finemente macinata da tessuto decellularizzato liofilizzato mediante criomacinazione. La ECM in polvere mantiene la sua composizione biochimica e può essere utilizzata per la sintesi di microcarrier.

Protocollo

1. Processamento dei tessuti decellularizzati

1. Decellularizzazione e liofilizzazione
   1. Decellularizzare i tessuti di interesse seguendo un protocollo stabilito.
      nota: Gli scaffold nel presente studio sono stati preparati seguendo i protocolli di decellularizzazione pubblicati per DAT umano, DDT suino e DLV suino. Il collagene insolubile, disponibile in commercio, può essere utilizzato anche per fabbricare schiume e microvettori, come il collagene proveniente dal tendine bovino, che è stato utilizzato con successo in un intervallo di concentrazione compreso tra 10 e 50 mg/mL. Possono essere utilizzate altre fonti di collagene insolubile, ma possono richiedere l'ottimizzazione per identificare l'intervallo di concentrazione che produrrà scaffold stabili.
   2. Trasferire il tessuto decellularizzato idrato o il collagene purificato in una provetta da centrifuga da 50 ml con una pinza e aggiungere una quantità sufficiente di acqua distillata doppia (ddH₂O) per immergere il tessuto, fino a un volume totale massimo di 35 ml.
   3. Congelare il campione per una notte a -80 °C, con la provetta da centrifuga posizionata orizzontalmente durante il congelamento per massimizzare la superficie per la sublimazione durante la successiva liofilizzazione.
   4. Rimuovere il tappo dalla provetta da centrifuga e trasferire il campione congelato in un barattolo di liofilizzazione.
   5. Liofilizzare il campione utilizzando un liofilizzatore da laboratorio per 48-72 ore o fino a completa asciugatura.
      nota: Il tempo di asciugatura può variare a seconda dei diversi liofilizzatori e tessuti decellularizzati.
   6. Tritare finemente la ECM liofilizzata in piccoli pezzi (~ 1–2 mm³) utilizzando forbici chirurgiche affilate.
   7. Conservare l'ECM tritato in un essiccatore fino al momento di un'ulteriore elaborazione.
      nota: Si consiglia di utilizzare immediatamente l'ECM tritato per evitare l'assorbimento di umidità dall'ambiente.
2. Criofresatura (opzionale per la fabbricazione di schiuma)
   1. Riempire una camera di macinazione in acciaio inossidabile da 25 mL per un sistema di macinazione a sfere da laboratorio con ECM liofilizzato tritato e aggiungere due sfere di macinazione in acciaio inossidabile da 10 mm.
   2. Chiudere e immergere completamente la camera di macinazione carica in azoto liquido per 3 minuti.
   3. Macinare il campione congelato per 3 minuti a 30 Hz (1.800 giri/min).
   4. Ripetere i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 fino a quando l'ECM non viene macinato in una polvere fine.
      nota: Il numero di volte in cui questi passaggi devono essere ripetuti può variare tra le fonti ECM. Ad esempio, DAT richiede in genere 3 cicli di macinazione per generare una polvere fine.
   5. Trasferire la polvere con una scoopula in una fiala di vetro, chiudere ermeticamente e conservare in un essiccatore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cavi a coccodrillo	VWR	Codice 470149-728
Alluminio	Fisher Scientifico	01-213-101
Bilancia analitica	Sartorius	CPA225D
Sistema di criomacinazione	Retsch	20.745.0001	MM 400
Essiccatore	Fisher Scientifico	8624426	Per la conservazione di ECM liofilizzate e bioscaffold
Fiaschetta Dewar	Fisher Scientifico	10-196-6	Forma bassa; gamma di volumi da 250 a 500 mL
Acqua bidistillata (ddH2O)			Dal sistema di purificazione dell'acqua GenPure xCAD di Barnstead
ECM (matrice extracellulare)			Isolato dal tessuto adiposo umano, dal derma suino o dal miocardio suino, come descritto in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010
forcipe	VWR	37-501-32	Per il trasferimento delle schiume
Congelatore (-20 °C)	VWR	97043-346
Congelatore ( -80 °C)	Termo Scientifico	EXF40086A
Fiale di vetro	Fisher Scientifico	03-339-26D	Per conservare la ECM criofresata liofilizzata
azoto liquido			Per elettrospruzzatura
Liofilizzante	Labconco	7750021	Zona libera4.5
Camera di macinazione	Retsch	02.462.0213	Volume consigliato di 25 ml
Sfere di fresatura	VWR	16003-606	Diametro 10 mm, acciaio inox consigliato
Penicillina-streptomicina	Tecnologie per la vita	Codice: 15140-122	Utilizzato per i mezzi di proliferazione
Pipet-Aid XP	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
Scoopula	VWR	Codice 89259-968	Per la raccolta di microvettori
Forbici chirurgiche	VWR	82027-590