Preparazione della sospensione ECM: una tecnica per ottenere una sospensione omogenea da una matrice extracellulare derivata dal tessuto

Abstract

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabbricazione di schiume e microvettori derivati da matrice extracellulare come piattaforme di coltura e somministrazione cellulare tessuto-specifiche. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video descrive la preparazione di una sospensione di matrice extracellulare omogeneizzata e digerita da tessuti decellularizzati e liofilizzati. Questa tecnica aiuta a fabbricare schiume porose derivate dalla ECM e microvettori da utilizzare come substrati in modelli avanzati di colture cellulari 3D.

Protocollo

1. Processamento dei tessuti decellularizzati

1. Decellularizzazione e liofilizzazione
   1. Decellularizzare i tessuti di interesse seguendo un protocollo stabilito.
      nota: Gli scaffold nel presente studio sono stati preparati seguendo i protocolli di decellularizzazione pubblicati per il tessuto adiposo decellularizzato umano (DAT), il tessuto dermico decellularizzato suino (DDT) e il ventricolo sinistro decellularizzato suino (DLV). Il collagene insolubile, disponibile in commercio, può essere utilizzato anche per fabbricare schiume e microvettori, come il collagene proveniente dal tendine bovino, che è stato utilizzato con successo in un intervallo di concentrazione compreso tra 10 e 50 mg/mL. Possono essere utilizzate altre fonti di collagene insolubile, ma possono richiedere l'ottimizzazione per identificare l'intervallo di concentrazione che produrrà scaffold stabili.
   2. Trasferire il tessuto decellularizzato idrato o il collagene purificato in una provetta da centrifuga da 50 ml con pinza e aggiungere una quantità sufficiente di acqua distillata doppia (ddH₂O) per immergere il tessuto, fino a un volume totale massimo di 35 ml.
   3. Congelare il campione per una notte a -80 °C, con la provetta da centrifuga posizionata orizzontalmente durante il congelamento per massimizzare la superficie per la sublimazione durante la successiva liofilizzazione.
   4. Rimuovere il tappo dalla provetta da centrifuga e trasferire il campione congelato in un barattolo di liofilizzazione.
   5. Liofilizzare il campione utilizzando un liofilizzatore da laboratorio per 48-72 ore o fino a completa asciugatura.
      nota: Il tempo di asciugatura può variare a seconda dei diversi liofilizzatori e tessuti decellularizzati.
   6. Tritare finemente la ECM liofilizzata in piccoli pezzi (~1–2 mm³) utilizzando forbici chirurgiche affilate.
   7. Conservare l'ECM tritato in un essiccatore fino al momento di un'ulteriore elaborazione.
      nota: Si consiglia di utilizzare immediatamente l'ECM tritato per evitare l'assorbimento di umidità dall'ambiente.
2. Criomacinazione
   1. Riempire una camera di macinazione in acciaio inossidabile da 25 mL per un sistema di macinazione a sfere da laboratorio con ECM liofilizzato tritato e aggiungere due sfere di macinazione in acciaio inossidabile da 10 mm.
   2. Chiudere e immergere completamente la camera di macinazione carica in azoto liquido per 3 minuti.
   3. Macinare il campione congelato per 3 minuti a 30 Hz (1.800 giri/min) in una polvere fine.
      nota: Il numero di volte in cui questi passaggi devono essere ripetuti può variare tra le fonti ECM. Ad esempio, DAT richiede in genere 3 cicli di macinazione per generare una polvere fine.
3. Preparazione della sospensione ECM
   1. Pesare 250 mg di ECM tritata (per schiume) o criomacinata (per schiume o microvettori) e trasferirla in una provetta da centrifuga da 15 mL. Fare riferimento al passaggio 1.1.6 e alla sezione 1.2 per la preparazione rispettivamente dell'ECM tritata e dell'ECM criomillata.
      nota: Questo protocollo è progettato per preparare una sospensione ECM da 50 mg/mL, raccomandata per DAT umano, DDT suino e DLV suino. A seconda della specifica fonte di ECM, possono essere generate sospensioni uniformi a concentrazioni iniziali più alte o più basse.
   2. Aggiungere 5 mL di tampone 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) alla provetta da centrifuga e segnare il livello del liquido sulla provetta.
   3. Preparare una soluzione madre di α-amilasi aggiungendo 7,5 mg di α-amilasi a 1 mL di tampone 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4). Aggiungere al campione 100 μl della soluzione madre di α-amilasi (0,75 mg di α-amilasi: 0,3% p/p di tessuto secco). Aggiungere 0,22 M NaH₂PO₄ per ottenere un volume finale di 10 mL.
   4. Agitare continuamente la sospensione a 300 giri/min per 72 ore a temperatura ambiente.
   5. Centrifugare la sospensione a 1.500 x g per 10 minuti. Raccogliere ed eliminare con cura il surnatante senza disturbare il pellet ECM digerito. Risospendere il materiale pellettato in 10 mL di NaCl al 5% diluito in ddH₂O.
   6. Ripetere il passaggio 1.3.5 per un totale di due risciacqui con il 5% di NaCl in ddH₂O.
   7. Scartare il surnatante e risospendere il materiale pellettato in 10 mL di ddH₂O.
   8. Agitare continuamente la sospensione a 300 giri/min per 10 minuti a RT.
   9. Centrifugare la sospensione a 1.500 x g per 10 minuti. Raccogliere ed eliminare con cura il surnatante senza disturbare il pellet ECM digerito.
   10. Aggiungere 0,2 M di acido acetico al segno di 5 mL indicato al punto 1.3.2.
   11. Agitare continuamente la sospensione a 120 giri/min O/N a 37 °C.
   12. Omogeneizzare la sospensione ECM a temperatura ambiente a intervalli di 10 secondi utilizzando un omogeneizzatore portatile dotato di una sonda a dente di sega larga 10 mm fino a quando non rimangono frammenti visibili. Posizionare la sospensione in un becher di acqua fredda tra gli intervalli di omogeneizzazione per evitare il surriscaldamento.
       nota: A seconda della fonte ECM, può essere necessaria un'ulteriore diluizione in acido acetico 0,2 M per ottenere una sospensione omogenea. Un raffreddamento eccessivo della sospensione ECM può provocare un aumento della viscosità che può interferire con un'omogeneizzazione efficiente. Se si nota un aumento della viscosità, il campione può essere riscaldato nuovamente a 37 °C e sottoposto a un'ulteriore lavorazione.
   13. Conservare a 4 °C per un massimo di un mese prima della fabbricazione della schiuma o del microcarrier.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido acetico, glaciale	BioShop	ACE222.5
α-amilasi	sigma	101074694	da Aspergillus aryzae
Centrifuga 75004251	Termo Scientifico		Con rotore a secchiello oscillante per provette da centrifuga da 15 e 50 mL
Provette da centrifuga (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Essiccatore	Fisher Scientifico	8624426	Per la conservazione di ECM liofilizzate e bioscaffold
Acqua bidistillata (ddH2O)			Dal sistema di purificazione dell'acqua GenPure xCAD di Barnstead
ECM (matrice extracellulare)			Isolato dal tessuto adiposo umano, dal derma suino o dal miocardio suino, come descritto in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Omogeneizzatore portatile	Fisher Scientifico	Codice 14-359-251	Velocità: 8.000 - 30.000 giri/min
Accessori omogeneizzatore: sonde del generatore di fondo a dente di sega	Fisher Scientifico	14-261-17	10 x 95 millimetri
azoto liquido
cloruro di sodio	BioShop	7647-14-5
Sodio fosfato monobasico	BioShop	Codice 10049-21-5
Forbici chirurgiche	VWR	82027-590