Fabbricazione di schiuma derivata da matrice extracellulare tramite liofilizzazione: una procedura per generare scaffold biologici da ECM di tessuti decellularizzati

Abstract

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabbricazione di schiume e microvettori derivati da matrice extracellulare come piattaforme di coltura e somministrazione cellulare tessuto-specifiche. (2017)

Questo video descrive il metodo per sintetizzare schiume pure derivate dalla ECM senza la necessità di reticolazione chimica. Queste schiume derivate dalla MEC trovano applicazioni come modelli avanzati di colture cellulari 3D in vitro o come bioscaffold pro-rigenerativi.

Protocollo

1. Fabbricazione di schiuma derivata da ECM

1. Preparare la sospensione omogenea dell'ECM disperdendo la polvere fine dell'ECM in una soluzione tampone e incubare a 37 °C con agitazione continua a 120 giri/min fino a quando la sospensione non è calda.
2. Diluire la sospensione ECM in acido acetico 0,2 M alla concentrazione desiderata.
   nota: A seconda della fonte ECM, le schiume stabili possono essere preparate nell'intervallo 10-100 mg/mL, con 15-50 mg/mL come intervallo raccomandato per DAT, DDT e DLV. In genere, le schiume fabbricate a concentrazioni più elevate saranno leggermente meno porose ma più stabili in coltura e più facili da maneggiare.
3. Utilizzando una siringa da 3 ml con un ago da 18 G per prevenire la formazione di bolle nella sospensione ECM, riempire lo stampo desiderato con la sospensione ECM. Per fabbricare le schiume DAT, DDT e DLV, erogare 400 μL di sospensione ECM da 35 mg/mL in una piastra trattata con coltura cellulare a 48 pozzetti.
   nota: La forma dello stampo selezionato e il volume della sospensione ECM determineranno la geometria della schiuma risultante.
4. Coprite e congelate gli stampini per una notte mettendoli in congelatore a -20 °C o -80 °C.
   nota: La temperatura di congelamento può influire sulla porosità delle schiume. Si prevedono pori più grandi quando i campioni vengono congelati a -20 °C rispetto a -80 °C a causa della formazione di cristalli di ghiaccio più grandi. Per fabbricare schiume con una struttura porosa uniforme, assicurarsi che lo stampo non sia a contatto con una superficie conduttiva per evitare il raffreddamento direzionale.
5. Mettere gli stampini contenenti i campioni congelati in un pallone liofilizzatore. Collegare il pallone liofilizzatore al sistema di liofilizzazione da laboratorio ed essiccare per 24 h.
   NOTA: È importante che il campione rimanga congelato prima della liofilizzazione.
6. Conservare le schiume liofilizzate in un essiccatore fino al momento del bisogno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bilancia analitica	Sartorius	CPA225D
Provette da centrifuga (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Provette da centrifuga (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Collagene da achilles bovino tendine (insolubile)	sigma	Codice: C9879	O simile collagene fonte; Può essere utilizzato come un alternativa a decellularizzato tessuti per fabbricare le schiume e microvettori
Essiccatore	Fisher Scientifico	8624426	Per ECM liofilizzata e stoccaggio di bioscaffold
Fiaschetta Dewar	Fisher Scientifico	10-196-6	Forma bassa; intervallo di volume da 250 a 500 mL
Acqua bidistillata (ddH_{2} O)			Da Barnstead GenPure xCAD Sistema di purificazione dell'acqua
D-PBS (fosfata-tamponato Soluzione salina)	bisonte europeo	311425125
ECM (matrice extracellulare)			Isolato dal adiposo umano Tessuto, derma suino o suino miocardio, come descritto in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
forcipe	VWR	37-501-32	Per il trasferimento delle schiume
Congelatore (-20 °C)	VWR	97043-346
Congelatore ( -80 °C)	Termo Scientifico	EXF40086A
Fiale di vetro	Fisher Scientifico	03-339-26D	Per conservare la criomacinata liofilizzata Ecm
azoto liquido			Per elettrospruzzatura
Liofilizzante	Labconco	7750021	Zona libera4.5
Ferri da 18 g	VWR	C ABD305185	Per l'erogazione di sospensioni ECM negli stampi
Agitatore per incubatore orbitale	SciLogex	832010089999	Temperatura controllata (37 °C)
Pipette sierologiche (10 mL)	Sarstedt	86.1254.001
Pipette sierologiche (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
cloruro di sodio	BioShop	7647-14-5
Sodio fosfato monobasico	BioShop	Codice 10049-21-5