Fabbricazione di bioscaffold mediante elettrospraying: una tecnica per generare scaffold di microcarrier derivati da matrice extracellulare di tessuto decellularizzato

Abstract

Fonte: Kornmuller, A. et al. Fabbricazione di schiume e microvettori derivati da matrice extracellulare come piattaforme di coltura e somministrazione cellulare tessuto-specifiche. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra la procedura di fabbricazione di microcarrier derivati da matrice extracellulare mediante elettrospraying. Questi microvettori simulano il microambiente nativo tessuto-specifico e sono stabili in modelli di coltura cellulare 3D in vitro a lungo termine.

Protocollo

1. Fabbricazione di microcarrier derivate da ECM tramite elettrospruzzatura

NOTA: Una panoramica della configurazione dell'elettrospruzzatura è mostrata nella Figura 1.

1. Incubare una sospensione ECM criofresata precedentemente preparata a 37 °C con agitazione continua a 100 giri/min O/N.
   nota: La ECM criofresata viene utilizzata per fabbricare i microcarrier derivati dalla ECM per garantire una maggiore uniformità nella sospensione e prevenire l'intasamento durante l'elettrospruzzatura.
2. Caricare 3 mL di sospensione ECM in una siringa Luer-Lock da 3 mL e collegare un set per infusione alato sul foro della siringa.
   nota: È possibile utilizzare una gamma di calibri dell'ago, riconoscendo che la selezione può influenzare le dimensioni e la forma dei microcarrier risultanti. Per fabbricare i microcarrier DAT, DDT e DLV, utilizzare un ago da 25G.
3. Fissare la siringa all'interno della pompa-siringa. Fissare l'ago a un supporto per storta e posizionare la punta dell'ago verticalmente a una distanza di 4-6 cm dalla parte superiore di un pallone di Dewar di forma bassa (si consiglia un intervallo di dimensioni da 250 a 500 ml).
4. Collegare un elettrodo a coccodrillo alla punta dell'ago e collegarlo al terminale positivo dell'alimentatore ad alta tensione.
5. Piegare una striscia di carta stagnola (12 x 5 cm) sul bordo del pallone sottovuoto.
6. Collegare un secondo elettrodo a coccodrillo al bordo esterno della pellicola e collegarlo al terminale della sorgente di terra dell'alimentatore.
7. Riempire il pallone Dewar con azoto liquido a circa 1 cm dall'alto in modo che 3/4 della pellicola sia sommersa.
   nota: È importante mantenere il pallone Dewar pieno di azoto liquido. Durante il processo di elettrospruzzatura, la superficie dell'azoto liquido non deve trovarsi a meno di 2 cm dalla sommità del pallone. Il rabbocco continuo dell'azoto liquido è necessario per mantenere un livello costante durante l'elettrospruzzatura.
8. Impostare la pompa a siringa su una velocità di infusione di 30 ml/h.
   nota: La variazione della velocità di infusione può alterare la forma e il diametro del microcarrier, ma l'intervallo consigliato è di 25-35 mL/h. Sebbene dipenda fortemente dalla viscosità della sospensione, portate inferiori a 25 mL/h possono portare alla generazione di microcarrier più grandi. A portate molto basse, le dimensioni e la forma dei microvettori possono diventare meno omogenee. A velocità di infusione superiori a 35 mL/h, l'uniformità delle goccioline generate tramite elettrospruzzatura può essere interrotta, dando luogo a microvettori non sferici con una distribuzione dimensionale più ampia.
9. Applicare una tensione di 20 kV e accendere la pompa a siringa per avviare l'elettrospruzzatura.
   nota: La tensione può essere variata per adattarsi alle dimensioni dei microcarrier e tende ad avere un impatto maggiore sul diametro rispetto alla velocità di infusione. L'intervallo di tensione consigliato è 15-25 kV. Si prevede una diminuzione del diametro del microcarrier con un aumento della tensione.
10. Una volta completata l'infusione, versare con cura l'azoto liquido in eccesso dal Dewar, lasciando i microcarrier sospesi in ~25 ml di azoto liquido per assicurarsi che rimangano congelati.
11. Trasferire immediatamente i microcarrier con l'azoto liquido in una provetta da centrifuga da 50 mL versando con un movimento regolare. Raccogli tutti i microcarrier congelati rimasti nel Dewar con una scoopula e aggiungili alla provetta da centrifuga.
    nota: A seconda delle dimensioni del Dewar, i microcarrier in azoto liquido possono essere inizialmente versati in un recipiente di medie dimensioni e poi trasferiti immediatamente nella provetta da centrifuga da 50 mL.
12. Coprire la provetta da centrifuga contenente i microcarrier in azoto liquido con un foglio di alluminio forato con piccoli fori in preparazione alla liofilizzazione.
13. Mettere le provette da centrifuga coperte in un pallone liofilizzatore. Collegare immediatamente il pallone al liofilizzatore e asciugare i campioni O/N.
    nota: È molto importante mantenere i microcarrier sospesi nell'azoto liquido per assicurarsi che non si scongelino prima di questa fase, poiché lo scongelamento può provocare il collasso e/o l'aggregazione. I microcarrier DAT, DDT e DLV fabbricati a una concentrazione di 35 mg/mL utilizzando le condizioni di elettrospruzzatura sopra descritte avranno tipicamente un diametro idrato compreso tra 350 e 500 μm. La distribuzione dimensionale può variare a seconda della sorgente ECM.
14. Conservare i microcarrier liofilizzati in un essiccatore fino al momento del bisogno.

Risultati

Figura 1. Panoramica dell'apparato di elettrospruzzatura utilizzato nella fabbricazione di microcarrier. A: Immagine che mostra la disposizione delle principali apparecchiature di elettrospruzzatura, compresa la pompa a siringa e l'alimentatore ad alta tensione, nonché il posizionamento dell'ago rispetto al Dewar dell'azoto liquido. B: Schema di elettrospruzzatura, compre...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cavi a coccodrillo	VWR	Codice 470149-728
Alluminio	Fisher Scientifico	01-213-101
Provette da centrifuga (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Provette da centrifuga (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Essiccatore	Fisher Scientifico	8624426	Per la conservazione di ECM liofilizzate e bioscaffold
Fiaschetta Dewar	Fisher Scientifico	10-196-6	Forma bassa; gamma di volumi da 250 a 500 mL
ECM (matrice extracellulare)			Isolato dal tessuto adiposo umano, dal derma suino o dal miocardio suino, come descritto in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 e Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
azoto liquido			Per elettrospruzzatura
Liofilizzante	Labconco	7750021	Zona libera4.5
Agitatore per incubatore orbitale	SciLogex	8.3201E+11	Temperatura controllata (37 °C)
Supporto per storta	VWR	Codice 470019-526
Morsetto per supporto per storta	VWR	Codice 21573-606
Siringa Safety-Lok	Bd	309606	Siringa Luer lock da 3 mL per la fabbricazione di microcarrier e l'erogazione di sospensioni ECM
Scoopula	VWR	Codice 89259-968	Per la raccolta di microvettori
Pompa a siringa	VWR	Codice 10117-490	Controllato da microprocessore
Alimentazione ad alta tensione	Ricerca Gamma Alta Tensione	ES30P-5W/DDPM	Capace di un intervallo di tensione consigliato di 15 - 25 kV
Set per infusione alato	Terumo	22258092	Lunghezza del tubo 30 cm, consigliati 25 G 3/4"; Possono essere utilizzati altri calibri dell'ago che possono influenzare il diametro del microcarrier