Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di goccioline di matrice semisolida (< 1 min per piastra)
- Posizionare una piastra di vetro pre-raffreddata su un blocco di ghiaccio sotto il microscopio operatorio. Assicurati che l'aliquota della matrice rimanga sempre sul ghiaccio.
- Posizionare una goccia di matrice da 1,5 μl in ciascuno dei quattro angoli della piastra con fondo di vetro con un micropipetter da 2 μl o 10 μl, lasciando una distanza almeno pari alla goccia stessa dal bordo del pozzetto di vetro.
- Posizionare la punta della pipetta direttamente sul vetro con un angolo di 45 gradi. Pipettare lentamente la matrice. Allontanarsi lentamente dal fondo del bicchiere dopo che la matrice è stata agganciata alla piastra.
nota: La tensione superficiale tra la matrice e il vetro dovrebbe creare ogni volta un emisfero perfetto.
- Interrompere il pipettaggio appena prima che il puntale sia vuoto perché l'iniezione involontaria di aria nella gocciolina della matrice rende il diametro della gocciolina della matrice molto maggiore ed è difficile da rimuovere.
nota: L'uso di una lancetta dei secondi per stabilizzare la mano di pipettaggio facilita un posizionamento più accurato.
2. Inserimento di DRG in goccioline di matrice semisolida (< 2 minuti per piastra)
- Lasciare brevemente la piastra con le goccioline della matrice a temperatura ambiente (~1 min). Questo irrigidisce leggermente la matrice, facilitando il posizionamento preciso del DRG.
- Raccogliere (non afferrare) delicatamente il DRG con una pinza microscopica chiusa nella mano sinistra. Anche in questo caso, uno sfondo scuro contro il piccolo DRG bianco facilita la visualizzazione. Trasferisci il DRG sulla punta di un ago da 21G nella mano destra. Questo trasferimento lascerà del fluido residuo sulla pinza.
- Inserire delicatamente il DRG al centro della gocciolina della matrice utilizzando l'ago 21G (Figura 1). Nella maggior parte dei casi, il DRG si sgancia facilmente nella matrice e quindi può essere posizionato centralmente con l'ago.
- Se il DRG si attacca all'ago, utilizzare la pinza microscopica per spingere il DRG fuori dall'ago e nella gocciolina della matrice. Eliminare il liquido in eccesso dalla pinza microscopica con una salvietta da laboratorio.
nota: L'introduzione di terreni nella matrice modificherà il diametro, il volume e la consistenza del saggio. Un blocco di ghiaccio con scritte colorate o colorate fornisce un contrasto di sfondo, che facilita la visualizzazione di questo delicato processo.
- Dopo che la piastra ha tutti e quattro i DRG, eseguire un'ispezione finale per assicurarsi che il DRG si trovi al centro della gocciolina della matrice. Effettuare le regolazioni necessarie con l'ago 21G.
- Trasferire la piastra completata in un incubatore a 37 °C. Questo solidificherà la matrice semisolida e fisserà il DRG in posizione.
- Ripetere questo processo per tutti i DRG. Posizionare le goccioline di matrice vuote senza un DRG come controllo negativo.
- Aggiungere 4 mL di DMEM con il 10% di terreno FBS a ciascuna piastra con fondo in vetro dopo aver completato tutte le piastre ed averle esposte all'incubatore a 37 °C per almeno 3 minuti. Posizionare la piastra con una leggera angolazione e aggiungere lentamente il terreno, in modo che entri gradualmente in contatto con le unità DRG della matrice.
nota: Se il fluido viene aggiunto troppo rapidamente o energicamente, la matrice e/o il DRG possono staccarsi.
- Conservare i saggi nell'incubatore a 37 °C per le successive 48-72 h.
nota: L'esame periodico dei saggi mostrerà la crescita circonferenziale dei neuriti verso il bordo della matrice (Figura 2). Quando i neuriti sono più grandi di tre quarti del percorso verso la matrice, è opportuno placcare le cellule.
3. Preparazione delle cellule tumorali della testa e del collo
NOTA: In questo disegno sperimentale possono essere utilizzate linee cellulari diverse dalle cellule di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo.
- Mantenere linee cellulari di carcinoma a cellule squamose in DMEM con il 10% di FBS in fiasche o piastre di coltura preferite in un incubatore a 37 °C. Per preparare le cellule per la sperimentazione, aspirare tutto il terreno dal pallone di coltura o dal piatto e lavarlo due volte con PBS. Sospendere le cellule aggiungendo una quantità appropriata di tripsina allo 0,025% per 5 minuti, seguita da DMEM con FBS al 10%. Pipettare 4 mL della miscela di cellule e terreni in piastre di coltura da 6 mL.
nota: Una piastra di coltura da 6 mL fornisce cellule più che sufficienti, anche quando meno del 50% è confluente.
- Esporre le linee cellulari HNSCC a condizioni diverse 24 ore prima della colorazione e della placcatura sul saggio DRG. Ridosare la condizione una volta che le cellule sono state piastrate per mantenere un ambiente costante.
nota: Aggiungere anticorpi, fattori di crescita, citochine o altre molecole alle piastre di coltura cellulare 1-2 giorni dopo la dissezione del topo e l'impianto del DRG nella matrice.
- Aggiungere coloranti cellulari fluorescenti 1 ora prima di placcare le cellule (2-3 giorni dopo il prelievo del DRG e l'impianto nella matrice).
nota: I particolari coloranti qui utilizzati passano liberamente attraverso la membrana cellulare; Tuttavia, dopo aver reagito con i gruppi tiolici intracellulari, la macchia rimane all'interno della cellula e viene trasmessa alle cellule figlie. La colorazione facilita notevolmente la visualizzazione all'interno dei saggi. Queste colorazioni temporanee sono ideali per questi saggi perché la fluorescenza è presente per 2-3 giorni, che è il periodo di tempo di questi esperimenti. Consente inoltre l'uso di molti colori diversi ed elimina la necessità di creare linee cellulari fluorescenti trasfettate con proteine.
- Preparare 10 μM di soluzione colorante mescolando 2 μL di coloranti per cellule madre da 10 mM in 2 mL di DMEM privo di siero per ogni condizione cellulare. Scaldare a 37 °C prima di aggiungerlo alle celle.
- Rimuovere il terreno di coltura all'interno della piastra da 6 mL, lasciando le cellule HNSCC aderenti sulla piastra. Aggiungere 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e rimuovere 2 mL di DMEM da 10 μM con colorazione/assenza di siero aggiunto a ciascuna piastra.
- Rimettere la piastra di coltura da 6 mL con la colorazione cellulare nell'incubatore a 37 °C per 40 minuti.
- Dopo 40 minuti, aspirare il terreno. Aggiungere 2 ml di PBS e poi aspirarlo. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,025% su ciascuna piastra e riposizionarla nell'incubatore a 37 °C.
- Aggiungere 2 mL di DMEM con il 10% di FBS dopo 3-5 minuti e trasferire le cellule sospese in una provetta conica da 15 mL. Ruotare le cellule e risospenderle in 1 mL di DMEM con il 10% di FBS.
- Contare le cellule con un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato e quindi aggiungere DMEM con il 10% di FBS per creare una concentrazione cellulare finale di 300.000 cellule per mL.
4. Placcatura delle cellule tumorali della testa e del collo
- Rimuovere le piastre con fondo in vetro con i saggi DRG a matrice dall'incubatore.
nota: Ancora una volta, sono appropriati quando i neuriti sono almeno al 75% del percorso verso il bordo della matrice, che generalmente si verifica dopo 2-3 giorni. Questo si vede meglio usando un obiettivo almeno 10X.
- Aspirare il fluido all'interno della piastra con fondo in vetro. Aspirare completamente il fluido all'interno del pozzetto del vetro senza rimuovere le unità matrix-DRG.
- Aspirare 200 μl delle 300.000 cellule/mL di terreno utilizzando una pipetta da 200 μl. Posizionare due gocce di cellule su ciascun test DRG a matrice. Eseguire questo passaggio per ogni gocciolina di matrice, creando quattro ripetizioni di ciascuna condizione di cella su una piastra.
nota: La forma emisferica della matrice consente alle cellule di depositarsi in un anello lungo la periferia del saggio (Figura 3a, Figura 3b). Trovare una pipetta con un grilletto liscio rende molto più facile il posizionamento di gocce uniformi.
- Confermare numeri cellulari simili e la distribuzione delle varie condizioni cellulari al microscopio 4X.
- Posizionare le piastre con fondo in vetro nell'incubatore a 37 °C per circa 60 min.
nota: Sebbene vi sia solo un piccolo volume di cellule e terreni (~150 μL), i saggi non si asciugano fino a quando non sono trascorse diverse ore di tempo nell'incubatore.
- Dopo 60 minuti, aggiungere delicatamente 4 ml di DMEM con il 10% di FBS lungo la parete laterale della piastra con fondo in vetro.
nota: Per un periodo di tempo, le cellule aderiscono parzialmente al fondo della piastra e il metodo di aggiunta del terreno non disturba le cellule. Diversi tipi di celle possono richiedere più o meno tempo per iniziare ad aderire alla piastra con fondo di vetro.
- Sostituire eventuali farmaci esogeni o fattori di crescita in questo momento per mantenere i livelli di concentrazione precedenti.
- Trasferire i saggi nell'incubatore a 37 °C, tranne quando vengono esaminati al microscopio. Quantificare i risultati di questo test mediante imaging microscopico. In breve, contare i filamenti di invasione perineurale all'interno di quattro quadranti utilizzando un'immagine microscopica 4X.
nota: Un microscopio con obiettivo 4X e capacità di fluorescenza è adeguato per documentare fotograficamente i saggi. La dimensione dei saggi si adatta perfettamente al campo di un obiettivo 4X, che è abbastanza dettagliato da catturare le singole aree di invasione perineurale. L'invasione perineurale diventa evidente entro 24 ore, ma oltre le 48 ore, l'integrità dei saggi inizia a indebolirsi, poiché le cellule tumorali si dividono lungo la periferia della matrice e invadono. Oltre le 48 ore, c'è anche un notevole afflusso di fibroblasti dal DRG, che oscura la visualizzazione con la microscopia a campo chiaro. Pertanto, si consiglia di fotodocumentare i risultati con la microscopia 4X almeno due volte durante questa finestra (ad esempio, a 24 e 48 ore dopo la piastratura delle cellule tumorali). Tieni presente che si tratta di saggi tridimensionali ed è difficile visualizzare completamente l'intero saggio. La maggior parte dell'invasione perineurale avviene in un piano dal fondo della piastra, dove le cellule sono incorporate nella matrice leggermente sopra il fondo della piastra. Poiché questo piano è vicino all'orizzontale, la stragrande maggioranza dei neuriti con cellule tumorali viene catturata in un'immagine a livello singolo a 4X.
