1. Selezione di una popolazione laterale (SP) mediante il saggio di efflusso colorante di Hoechst
- Colorazione di 50 milioni di cellule con il colorante Hoechst 33342
- Preparare due provette sterili da 15 ml con fondo conico: una provetta etichettata "Hoechst" e l'altra etichettata "Hoechst e Verapamil". Preparare 10 mL di soluzione 5 mM di Verapamil cloridrato in acqua sterile. Preparare il terreno di coltura (CM) per le cellule staminali.
- Per preparare la CM per la CSC (CM-CSC), combinare quanto segue: Terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM): F12 (1:3, v:v), 5% di siero fetale di vitello (FCS), 0,04 mg/L di idrocortisone, 100 U/mL di penicillina, 0,1 g/L di streptomicina e 20 μg/L di fattore di crescita epidermico (EGFR).
- Sotto una cappa a flusso laminare, tripsinizzare le cellule. Rimuovere il terreno, lavare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS) e aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA (0,5 g/L) per un matraccio da 75 cm². Incubare 3 minuti a 37 °C. Arrestare la reazione aggiungendo un terreno di coltura utilizzato per la linea cellulare parentale. Conta il numero di celle utilizzando un contatore di celle.
- Per preparare il CM per la linea cellulare parentale (CM-P), integrare il DMEM con FCS al 10%, 0,4 mg/L di idrocortisone, 100 U/mL di penicillina e 0,1 g/L di streptomicina).
- Diluire la sospensione cellulare ottenuta al punto 1.1.2 per ottenere 10-7 cellule/mL in CM-P. Scissione della sospensione cellulare nelle due provette preparate: mettere 100 μL (106 cellule) nella provetta "Hoechst e Verapamil" e 4 mL (4 x 107 cellule) nella provetta "Hoechst".
- Nel campione "Hoechst e Verapamil", aggiungere 10 μl di soluzione di Verapamil cloridrato da 5 mM (concentrazione finale: 0,5 mM) e mescolare delicatamente. Aggiungere 5 μL di soluzione Hoechst da 1 g/L (concentrazione finale: 0,1 g/L). Nel campione "Hoechst", aggiungere 5 μl di soluzione Hoechst da 1 g/L per 106 celle (200 μl totali). D'ora in poi, mantenere i campioni protetti dall'esposizione diretta alla luce utilizzando un foglio di alluminio.
- Incubare tutte le provette a bagnomaria a 37 °C per 1 ora e 30 minuti. Mescolare delicatamente ogni 15 minuti per evitare che le cellule si depositino.
- Centrifugare le provette a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet con 2 mL di 1x PBS.
- Centrifugare le provette a 250 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet "Hoechst e Verapamil" in 500 μL di ioduro di propidio (PI) 5 mg/L diluito in tampone PBS e il pellet "Hoechst" in 4 mL di 5 mg/L di PI diluito in tampone PBS.
- Trasferire le soluzioni del campione attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere gli aggregati e raccogliere singole cellule in provette per l'assorbimento del campione sul citometro a flusso. Conservare i campioni sul ghiaccio e proteggerli dall'esposizione diretta alla luce utilizzando un foglio di alluminio.
2. Isolamento della popolazione laterale escluso il colorante Hoechst mediante selezione cellulare
- Eseguire la separazione delle cellule negative di Hoechst su un selezionatore di citometria a flusso con i seguenti parametri: laser UV (355 nm), due rivelatori sul percorso del laser UV con filtri Hoechst blu (450/50 BP) e Hoechst rosso (610/20 BP) e due collettori.
- Innanzitutto, analizzare il campione "Hoechst" che funge da controllo positivo per la colorazione e l'impostazione del citometro a flusso.
- Utilizzando il software del citometro, nella finestra "Foglio di lavoro globale", fare clic su "Dot Plot" (quinta immagine in alto a destra) e creare un grafico sul foglio di lavoro globale. In ordinata, con un clic destro, selezionare FSC-A (scatter in avanti) e in ascissa, SSC-A (scatter laterale) (Figura 1A). Allo stesso modo, creare un dot plot SSC-W rispetto a SCC-H. In questo secondo dot plot, per creare una regione P1, fare clic su "Polygon gate" (quattordicesima immagine in alto a destra) (Figura 1B).
nota: La regione P1 comprenderà singole cellule e discriminerà i doppietti.
- Facoltativo: escludere le celle PI positive creando un FSC-A rispetto a PI gated su P1. In questo dot plot, selezionare la popolazione PI negativa (P2) per escludere le cellule morte PI positive.
- Utilizzando il software del citometro, nella finestra "Foglio di lavoro globale", fare clic su "Dot Plot" e creare un grafico sul foglio di lavoro globale. Sull'ordinata, con un clic destro, selezionare il blu Hoechst-A e in ascissa, il rosso Hoechst-A. Con un clic destro sulla popolazione, selezionare "Mostra popolazione" e P1. In questo dot plot, creare una regione (P2) per selezionare le celle negative della popolazione laterale del colorante di Hoechst (SP) che appaiono come un braccio laterale a sinistra della popolazione principale di celle (Figura 1C).
- Analizza il campione "Hoechst" e raccogli 10.000 eventi. Per assicurarsi che il gate P2, che rappresenta la popolazione SP, sia ben posizionato, analizzare il campione "Hoechst e Verapamil" (10.000 eventi) per osservare la scomparsa della popolazione SP (Figura 1D).
- Raccogliere le cellule negative del colorante SP Hoechst in una provetta da 15 mL contenente 1 mL di CM-CSC preparata al punto 1.1.1.
- Al termine della selezione cellulare, centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 1 mL di CM-CSC. Contare il numero di cellule ordinate utilizzando un contatore di cellule e trasferire un numero appropriato di cellule in un pallone di coltura (vedere la Tabella 1). Aggiungere CM-CSC e incubare a 37 °C e 5% di CO2 atmosfera.
- Mantenere le cellule in coltura nelle stesse condizioni per un massimo di due passaggi fino a raggiungere un minimo di 5 x 107 cellule.
Tabella 1: Tipo di matraccio di coltura da utilizzare in base al numero di cellule selezionate. Vengono forniti i dettagli delle dimensioni del pallone di coltura per un numero approssimativo di cellule selezionate. Vengono forniti anche il volume di tripsina e il volume del terreno necessari per il tipo di matraccio di coltura.
| Numero di celle ordinate | Tipo di fiaschetta di coltura | Volume di tripsina (mL) | Volume del terreno di coltura (mL) |
| 10.000-200.000 | 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti o di una capsula di Petri da 3,5 cm | 0,5 | numero arabo |
| 200.000-1.000.000 | 1 pallone di coltura T25 | 1 | 4 |
| >1.000.000 | 1 pallone di coltura T75 | numero arabo | 10 |
