1. Saggio MTT per cellule leucemiche
- Preparare in anticipo la soluzione MTT: Sciogliere 500 mg di MTT formazan in 10 mL di PBS e agitare (al riparo dalla luce) con un agitatore magnetico per circa 1 ora. Sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,22 μm.
nota: La soluzione può essere conservata in aliquote da 10 mL a -20 °C. Proteggere dalla luce diretta dopo lo scongelamento.
- Preparare in anticipo l'isopropanolo acidificato: aggiungere 50 ml di HCl 2 M a 2,5 L di isopropanolo.
nota: Conservare la soluzione per almeno un mese a temperatura ambiente prima dell'uso. Se l'isopropanolo non viene acidificato correttamente, potrebbe formare precipitati con il mezzo e compromettere la lettura spettrofotometrica.
- Preparare una piastra separata a fondo piatto a 96 pozzetti "Giorno 0" (controllo) per garantire una stima più accurata dell'inibizione della crescita: dedicare da 3 a 6 pozzetti per linea cellulare, aggiungere 30 μL di terreno di crescita e 120 μL di sospensione cellulare (8.000 cellule) per ciascun pozzetto e 150 μL di terreno di crescita ai pozzetti corrispondenti ai bianchi (senza cellule). Procedere dal passaggio 1.9 al passaggio 1.13 di questa sezione per misurare la densità ottica (OD).
- Preparare una piastra sperimentale a fondo piatto da 96 pozzetti: dedicare 30 pozzetti alle concentrazioni di farmaci (10 concentrazioni, ciascuna in triplicato), 10 pozzetti alle cellule di controllo e 10 pozzetti al mezzo di controllo senza cellule (bianchi) e preparare un intervallo di diluizione del farmaco di desametasone (Dex) utilizzando il dimetilsolfossido come solvente.
nota: Per le celle CEM-WT, l'intervallo di diluizione Dex è compreso tra 2 μM e 0,97 nM. Per le celle CEM/R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, l'intervallo di diluizione Dex è compreso tra 640 μM e 0,33 nM.
- Aggiungere 30 μl da ciascuna diluizione Dex in un pozzetto appropriato della piastra a 96 pozzetti. Assicurati di includere ogni concentrazione in un triplicato.
- Aggiungere 30 μl di terreno di crescita ai pozzetti corrispondenti alle cellule di controllo e 150 μl di terreno di crescita ai pozzetti corrispondenti ai bianchi.
- Raccogliere cellule a crescita esponenziale e risospendere alla loro concentrazione ottimale di semina.
nota: Al fine di determinare le concentrazioni ottimali delle cellule iniziali, si raccomanda di valutare il profilo di crescita di ciascuna linea cellulare in una piastra a 96 pozzetti seminando cellule a diverse concentrazioni e misurandole quotidianamente per almeno 4 giorni. Scegliere una concentrazione di semina che impedisca la crescita eccessiva delle cellule dopo 72 ore, in quanto ciò influenzerà l'esperimento saturando i valori di OD. Per CEM-WT, CEM-C5 e CEM-R5, la concentrazione ottimale di semina è di 8.000 cellule/pozzetto, mentre per CEM/R30dm è di 5.000 cellule/pozzetto.
- Aggiungere 120 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente la soluzione farmacologica o il terreno di crescita (pozzetti corrispondenti alle cellule di controllo). Riempire i pozzetti esterni vuoti della piastra con 150 μl di PBS per garantire una buona umidità nella piastra e incubare le piastre per 72 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore per colture cellulari.
- Aggiungere 15 μl della soluzione MTT a ciascun pozzetto e agitare la piastra per 5 minuti con uno shaker per piastre fino a un massimo di 900 agitazioni/min.
- Riposizionare le piastre a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore per colture cellulari e incubare per altre 4-6 ore.
- Aggiungere 150 μl di isopropanolo acidificato a ciascun pozzetto e mescolare bene con una pipetta multicanale per risospendere completamente tutti i cristalli di formazan. Inizia con i pozzetti vuoti e assicurati di sciacquare bene le punte prima di procedere con un'altra fila del piatto.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti.
- Utilizzando un lettore di micropiastre, determinare il diametro esterno a 540 e 720 nm per garantire una misurazione accurata correggendo il diametro esterno di fondo. Quindi, salva i dati in un foglio di calcolo e analizzalo.
2. Analisi dei dati per il saggio MTT
- Calcola i valori OD delle celle al "Giorno 0" utilizzando la seguente formula:
OD Giorno 0 =Celle di controllo OD -Pozzetti bianchi OD medi
- Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute per ogni concentrazione di farmaco secondo la seguente formula:
% Cellule trattate = Media [Cellule trattate con OD - Mediadei pozzetti in bianco OD -OD Giorno 0]/[Celle di controllo OD - Mediadei pozzetti in bianco OD -OD Giorno 0]*100
- Tracciare la curva dose-risposta (concentrazione del farmaco vs. inibizione della crescita in %).
- Calcolare la concentrazione del farmaco che inibisce la crescita delle cellule del 50% (IC50) utilizzando la curva dose-risposta.
