Screening della morte cellulare mediante colorazione DAPI: un metodo per lo screening rapido della morte cellulare clonogenica indotta da IR in linee cellulari cancerose

Abstract

Fonte: Kobayashi, D. et al. Protocollo in un solo passaggio per la valutazione della modalità di morte cellulare clonogenica indotta da radiazioni mediante microscopia a fluorescenza. (2017)

Questo video dimostra la metodologia per lo screening dei principali profili di morte cellulare cellulare nelle linee cellulari tumorali indotte da radiazioni ionizzanti (IR) utilizzando il saggio di colorazione DAPI. I nuclei colorati con DAPI delle cellule bersaglio in fase di morte cellulare mostrano morfologie distinte e possono essere facilmente identificati mediante microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Preparazione dei materiali

1. Vetrini coprioggetti per autoclave
   1. Mettere i vetrini coprioggetti in un bicchiere di vetro.
   2. Coprire il bicchiere di vetro con un foglio.
   3. Autoclavare a 121 °C a 15 psi per 20 min.
   4. Asciugare a 50 °C. Conservare a temperatura ambiente in una cappa di coltura.
2. Preparare la soluzione di fissaggio: 3% paraformaldeide + 2% saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
   1. In un flacone di vetro da 1.000 ml, aggiungere 700 ml di PBS e 30 g di paraformaldeide.
      cautela: La paraformaldeide è corrosiva, indos....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino di copertura	Matsunami	C013001
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
saccarosio	Sigma-Aldrich	84097-250G
Soluzione salina tamponata con fosfati	Cosmo Bio	Codice 16232000
bisturi	Kai Medical	No.20, 520-A
piastra per coltura cellulare da 35 mm	Falcone	353001
microscopio a fase invertita	Shimazu	114-909
Irradiatore a raggi X	Bioptici di Faxitron	Faxitron RX-650
piatto di coltura quadrato	Corning	Numero 431110
vetri scorrevoli	Matsunami	Pro-11
reagente colorante DAPI	Segnalazione cellulare	8961S
Microscopio a fluorescenza	Nikon	ECLIPSE Ni
microscopio a fluorescenza con filtro DAPI	Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
Lente per microscopio a fluorescenza (20×)	Nikon	Piano Apo λ 20X/0,75
Lente per microscopio a fluorescenza (60×, olio)	Nikon	Olio Plan Apo λ 60X/1.40
olio	Olimpo	N5218600
Telecamera CCD	Nikon	DS-Qi2
Software di acquisizione di immagini digitali	Nikon	Documento NIS-Elements
detergente per lenti	Olimpo	OT0552
cloroformio	Wako	Codice 035-02616