1. Preparazione dei materiali
- Vetrini coprioggetti per autoclave
- Mettere i vetrini coprioggetti in un bicchiere di vetro.
- Coprire il bicchiere di vetro con un foglio.
- Autoclavare a 121 °C a 15 psi per 20 min.
- Asciugare a 50 °C. Conservare a temperatura ambiente in una cappa di coltura.
- Preparare la soluzione di fissaggio: 3% paraformaldeide + 2% saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
- In un flacone di vetro da 1.000 ml, aggiungere 700 ml di PBS e 30 g di paraformaldeide.
cautela: La paraformaldeide è corrosiva, indossare guanti adeguati.
- Sciogliere completamente la paraformaldeide riscaldando a 80 °C con un forno a microonde.
cautela: I fumi di paraformaldeide sono tossici, indossare una maschera.
- Lasciare a temperatura ambiente per una notte.
- Aggiungere 20 g di saccarosio.
- Aggiungere PBS per rendere il volume totale di 1 L.
- Aliquotazione in provette da 50 mL. La soluzione di fissazione può essere conservata per 3 anni a -20 °C o per 3 mesi a 4 °C.
2. Irradiazione
ATTENZIONE: Maneggiare l'irradiatore a raggi X con cura secondo le istruzioni del produttore.
- Esaminare le cellule al microscopio in fase invertita. Verificare che le cellule siano attaccate al vetrino coprioggetti e vive.
- Irradiare la parabola con 6 raggi X Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Incubare per 72 ore a 37 °C in atmosfera contenente il 5% di CO2,
nota: Il tempo di incubazione può essere modificato in base al disegno sperimentale
3. Fissazione
- Aspirare i terreni di coltura dalla piastra.
- Usando le forbici, tagliare la punta di una punta per micropipetta da 1.000 μl a 5 mm dall'estremità.
nota: La punta tagliata aiuta ad applicare senza problemi la soluzione di fissaggio.
- Utilizzando la punta tagliata, aggiungere 1 ml di soluzione di fissazione (preparata al punto 1.2) al piatto dalla parete laterale del piatto.
nota: Questo passaggio è sensibile al fattore tempo e deve quindi essere eseguito senza cambiare i puntali delle micropipette quando si maneggiano più campioni. L'applicazione della soluzione di fissazione direttamente sul fondo del piatto può danneggiare le cellule.
- Metti il piatto in un piatto di coltura quadrato. Agitare delicatamente il piatto di coltura quadrato per distribuire uniformemente la soluzione di fissazione sul vetrino coprioggetti.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione di fissaggio dal piatto.
- Aggiungere 2 ml di PBS alla piastra dalla parete laterale della capsula.
nota: L'applicazione di PBS direttamente sul fondo del piatto può danneggiare le cellule.
- Aspirare il PBS dal piatto.
- Ripetere i passaggi 3.7 e 3.8 due volte.
nota: La capsula può essere conservata per 1 settimana a 4 °C con i vetrini coprioggetti immersi in 2 mL di PBS.
4. Colorazione DAPI
- Su un vetrino, applicare 5 μL 1 μg/mL di reagente di colorazione DAPI.
nota: Il reagente di colorazione DAPI è stabile per 6 mesi se conservato al riparo dalla luce a una temperatura pari o inferiore a -20 °C.
- Usando un bisturi, rimuovere il vetrino coprioggetti dal piatto.
- Prelevare il PBS in eccesso sul vetrino coprioggetti toccando il bordo del vetrino con un tovagliolo di carta.
- Montare il vetrino coprioggetti capovolto sulla goccia di reagente di colorazione DAPI sul vetrino in modo che le cellule siano esposte al reagente di colorazione DAPI.
nota: Questo passaggio è sensibile al fattore tempo. L'essiccazione del reagente di colorazione DAPI può portare a una colorazione non ottimale.
- I campioni possono essere conservati per 1 anno a -20 °C.
