Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di scaffold esofageo decellularizzato
- Ottenere esofagi suini intatti in un macello da suini Landrace appena macellati che vengono utilizzati per la produzione alimentare. Un singolo esofago fornirà impalcature sufficienti per circa 30 costrutti separati.
nota: A causa dell'ampio e dispendioso protocollo di sterilizzazione richiesto, normalmente vale la pena ottenere ed elaborare un minimo di 10 esofagi alla volta.
- Posizionare immediatamente l'esofago appena asportato in un vaso sterile da 180 ml contenente circa 150 ml di soluzione di iodio povidone al 10% per 5 minuti per ridurre la carica microbica contaminante. Trasferire l'esofago in un secondo vaso contenente circa 100 ml di PBS sterile contenente 200 UI/mL di penicillina, 200 μg/mL di streptomicina e 1,25 μg/mL di amfotericina B.
- Riposizionare il coperchio del contenitore e trasportare l'esofago in laboratorio a temperatura ambiente. Due o tre esofagi possono essere trasportati in ogni contenitore, a seconda delle loro dimensioni.
- Una volta in laboratorio, maneggiare il tessuto in una cappa a flusso laminare utilizzando una tecnica asettica per ridurre al minimo la contaminazione microbica. Sterilizzare pinzette, forbici e lame per bisturi immergendoli per 5 minuti in etanolo al 70% e risciacquando in PBS sterile.
- Maneggiare l'esofago utilizzando una pinzetta sterile. Usando le forbici, tagliare l'esofago longitudinalmente. Sciacquare il fazzoletto inserendo l'esofago in un vaso sterile da 180 ml contenente circa 100 ml di PBS sterile e agitare delicatamente per rimuovere eventuali detriti.
- Pulire una tavola di dissezione in sughero spruzzando abbondantemente con etanolo al 70% e lasciare asciugare.
- Rimuovere l'esofago dal PBS e, utilizzando aghi sterili, fissare l'esofago sulla tavola, con la superficie della mucosa rivolta verso l'alto. Afferrare la superficie della mucosa a un'estremità dell'esofago con una pinzetta sterile e allontanarla dalla tavola. Questo separerà la mucosa dalla sottomucosa sottostante.
- Quindi, utilizzare una lama di bisturi sterile per sezionare l'esofago longitudinalmente lungo la lamina propria, rimuovendo i perni man mano che la dissezione procede per consentire il sollevamento della mucosa.
- Conservare la mucosa sezionata e scartare la sottomucosa sottostante.
- Tagliare e scartare i 2 cm più prossimali e distali della mucosa poiché c'è un numero maggiore di ghiandole sottomucose e una lamina propria più spessa in quelle aree, rispettivamente.
- Utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto rimanente in 5 cm2. Mettere tutto il tessuto tagliato in un vaso sterile da 180 ml contenente circa 150 ml di PBS sterile e agitare delicatamente per risciacquare il fazzoletto. Se si elaborano più di cinque esofagi contemporaneamente, potrebbe essere necessario utilizzare più vasi per questo e i tre passaggi successivi.
- Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire il tessuto tagliato in un vaso da 180 ml contenente 150 ml di NaCl sterile 1 M, 200 UI/ml di penicillina, 200 μg/ml di streptomicina e 1,25 μg/ml di amfotericina B. Incubare per 72 ore a 37 °C.
- Mettere il fazzoletto in un barattolo fresco da 180 ml contenente 150 ml di PBS sterile. L'epitelio avrà iniziato a separarsi visibilmente dal tessuto sottostante. Sbucciare delicatamente l'epitelio staccato dall'esofago di maiale usando una pinza sterile e gettarlo.
- Mettere il fazzoletto rimanente in un barattolo fresco da 180 ml e aggiungere 150 ml di PBS sterile. Agitare delicatamente per 5 minuti per lavare. Versare il PBS e ripetere altre due volte con PBS fresco.
- Mettere tutto il tessuto in un flacone di vetro da 500 mL contenente 400 mL di soluzione sterile di glicerolo all'80% (v/v) per 24 ore a temperatura ambiente. Trasferire in 400 mL di soluzione sterile di glicerolo al 90% (v/v) per altre 24 ore.
- Conservare in 400 ml di soluzione sterile di glicerolo al 100% a temperatura ambiente per un minimo di 4 mesi per disidratare e sterilizzare il tessuto preservando l'integrità della membrana basale.
