Estrazione di esosomi basata su biglie magnetiche: una tecnica per isolare esosomi specifici dai biofluidi

Abstract

Fonte: Tu, M. et al. Rilevamento di biomarcatori esosomiali mediante rilascio e misurazione indotti da campo elettrico (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo una procedura per isolare gli esosomi dai biofluidi bersaglio utilizzando microsfere magnetiche. La procedura consente la cattura rapida degli esosomi, che possono essere utilizzati per l'analisi a valle.

Protocollo

1. Estrazione di esosomi basata su biglie magnetiche

1. Pipettare una soluzione ben miscelata di 5 μl di microparticelle magnetiche rivestite di streptavidina in 495 μl di tampone salino tamponato con fosfato (PBS) in una provetta da microcentrifuga per risospendere le microsfere. Lavare e risospendere le perle con 500 μL di PBS tre volte utilizzando una griglia magnetica. Il rack è costituito da una serie di magneti sul lato di un'unità di alloggiamento che può contenere le provette per microcentrifuga del campione.
   1. Per ogni lavaggio, prima lasciare riposare le provette sulla griglia per 1 minuto e poi utilizzare una punta di pipetta per rimuovere con cura il tampone surnatante senza disturbare le perline.
   2. Posizionare le provette su una normale rastrelliera senza magneti laterali. Aggiungere 500 μl di PBS nelle provette e utilizzare la pipetta per mescolare la soluzione e le microsfere. Quindi, rimetti le provette sulla rastrelliera magnetica per separare nuovamente le perle dalla soluzione.
   3. Eseguire questa rimozione del tampone tramite magnetizzazione e risospensione in PBS per un totale di tre volte. In questo modo viene eseguito un lavaggio iniziale delle particelle magnetiche.
2. Risospendere le perle in 490 μL di tampone PBS, con la provetta posizionata sulla parte non magnetizzata del rack magnetico. Pipettare 5 μL di anticorpo CD63 umano di topo biotinilato alla concentrazione madre di 1,0 mg/mL nella miscela di perline. Utilizzare la pipetta per mescolare le perle e l'anticorpo in soluzione.
3. Posizionare le provette per microcentrifuga con una miscela di perline e anticorpi biotinilati su un rotatore per campioni. Impostare i parametri del rotatore per campioni per la rotazione reciproca a 90°, inclinabile per 5 s e vibrante a 5° per 1 s. Ruotare le provette della miscela di perle del campione a questi parametri per 30 minuti a RT.
4. Rimuovere l'anticorpo non legato dopo la coniugazione.
   1. Dopo 30 minuti di rotazione a RT, riposizionare le provette nel rack magnetico per 5 minuti.
   2. Eseguire tre lavaggi delle microsfere rimuovendo la fase liquida utilizzando una micropipetta e lavare con 500 μL di PBS. Dopo il triplo lavaggio, risospendere le perle in 490 μL di caseina-PBS e posizionarle sulla parte non magnetizzata del rack.
5. Estrazione degli esosomi mediante perle rivestite di anticorpi.
   1. Etichettare ogni provetta con l'ID del campione desiderato. Pipettare un campione di 10 μl di siero o saliva nella provetta per microcentrifuga. Utilizzare la pipetta per miscelare il campione e le microsfere magnetiche pipettando più volte.
   2. Posizionare le provette con il campione e le perle di anticorpi CD63 anti-umano sul rotatore e ruotare per 2 ore a RT. Utilizzare gli stessi parametri del rotatore descritti al punto 1.3.
   3. Dopo 2 ore di rotazione del campione, eseguire un triplo lavaggio magnetizzando per separare le perle dalla soluzione, rimuovendo la fase liquida con una micropipetta e risospendendo le perle in 500 μL di tampone Tris-HCl. Le perle risultanti sono ora legate agli esosomi e sono pronte per il rilascio e la misurazione del campo elettrico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo CD63 anti-umano biotinilato	Ancell, Stati Uniti	Codice 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidina T1	Invitrogen, Stati Uniti	Codice 65601
Magnetismo al neodimio (1/10" di diametro x 1/32" di spessore)	K&J Magnetics, Stati Uniti	DH101
Acqua distillata ultrapura	Life Technologies, Stati Uniti	Codice 10977-023
Anti-Fluoresceina-POD, Frammenti Fab	Roche, Germania	11426346910
Soluzione salina tamponata con fosfato	Life Technologies, Stati Uniti	10010023
Caseina/PBS	Fisher Scientific, Stati Uniti	Telefono 37532