$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Digestione dei tessuti
- Utilizzando una piastra di coltura tissutale da 100 mm, tritare meccanicamente il tessuto in pezzi sottili di dimensioni ~1-2 mm utilizzando forbici da dissezione sterilizzate in autoclave e pinze chirurgiche (Figura 1B, C). Il tessuto connettivo tra i pezzi deve essere tagliato per garantire una corretta separazione e facilità nelle fasi successive.
- Aggiungere 6 mL della soluzione di dispasi/collagenasi al tessuto tritato. Quindi incubare a 37°C per circa 30 minuti - 1 ora.
- Disgregare il tessuto pipettandolo con una pipetta sierologica da 5 ml 15-20 volte.
- Incubare a 37°C per altri 30 minuti a 1 ora.
- Ripetere i passaggi 1.3 e 1.4 altre due-tre volte o fino a quando il tessuto assomiglia a un impasto liquido e può passare facilmente attraverso l'apertura della pipetta (Figura 1D).
nota: La dimensione iniziale del campione di tessuto e la finezza della macinazione del tessuto determineranno il numero di volte in cui è necessario ripetere i passaggi 1.3 e 1.4. In genere, riceviamo un tessuto di circa 1 cm x 1 cm. Inoltre, è possibile monitorare la dissociazione tissutale utilizzando un microscopio standard per colture tissutali invertite per monitorare il progresso della dissociazione cellulare dal tessuto. Piccoli gruppi di cellule sono ideali per la crescita iniziale delle cellule salivari come salisfere.
2. Pozzetti di rivestimento con matrice a membrana basale
NOTA: La matrice della membrana basale (BMM) dovrebbe essere scongelata durante la notte a 4°C il giorno prima di essere utilizzata. Una volta scongelato, il BMM deve essere mantenuto costantemente su ghiaccio o a 4°C poiché si solidifica rapidamente (cioè forma un gel) a temperature più calde. Inoltre, è necessario prestare attenzione se i campioni sono stati raffreddati su ghiaccio prima della placcatura su BMM poiché i campioni freddi "scioglieranno" il BMM ed esporranno le cellule al piatto di plastica.
- Pipettare lentamente il BMM (vedere la Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto da rivestire. Distribuire uniformemente e lentamente il BMM sul pozzo.
NOTA: Generalmente, utilizziamo 500 μl per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, ma questo volume può essere regolato per l'uso su altre varianti di piastre, come 12 pozzetti o 24 pozzetti, o a piacere per idrogel più spessi o più sottili.
- Incubare le piastre rivestite a 37°C per almeno 15 minuti prima dell'uso per consentire al BMM di solidificarsi.
3. Filtraggio di tessuti non digeriti, lisi dei globuli rossi e placcatura cellulare
- Trasferire l'omogeneizzato tissutale dallo stadio 1,5 a una provetta conica da 15 mL. Lavare una volta la piastra con 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) per trasferire le cellule rimanenti.
- Filtrare l'omogenato in una provetta conica da 50 mL attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 70 μm per rimuovere il tessuto non digerito. Centrifugare le celle filtrate per 5 minuti a 500 x g.
- Diluire 10 tamponi di lisi RBC in dH2O sterile per ottenere una soluzione di lavoro 1x.
- Aspirare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet cellulare in 10 mL di tampone di lisi 1x RBC. Incubare per 5 minuti a 37°C.
- Aggiungere 20-25 mL di DPBS per neutralizzare il tampone di lisi dei globuli rossi e ridurre al minimo la lisi delle cellule salivari. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
nota: Dopo il trattamento con tampone di lisi dei globuli rossi, il pellet cellulare deve essere bianco. Il colore rosso del pellet indica che non tutti i globuli rossi sono stati completamente lisati. Ripetere i passaggi da 3.4 a 3.5, se necessario, per la lisi completa di tutti i globuli rossi.
- Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 1-2 mL di BEGM per pozzetto, quindi posizionare le cellule risospese su pozzetti rivestiti di BMM. Incubare a 37°C.
- Una volta piastrate su BMM, le cellule si formeranno in strutture sferiche o "salisfere" per un periodo di 2-3 giorni. Le cellule possono essere mantenute come salisfere per circa 5-7 giorni prima che il BMM inizi a degradarsi, consentendo alle cellule di accedere e aderire alla plastica e crescere come un monostrato.