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1. Preparazione delle sonde di nanoparticelle
NOTA: Questo test utilizza nanobarre d'oro funzionalizzate (AuNR; 25 nm di diametro x 71 nm di lunghezza) che sono coniugate covalentemente con polimeri di neutravidina (AV) e hanno un picco di risonanza plasmonica di superficie che produce un segnale di diffusione rosso (641 nm di picco) sull'illuminazione DFM.
- Lavare tre volte 40 μL di AuNR-AV (2,56 x 1011 particelle) con 200 μL di PBS (pH 7,0) mediante centrifugazione e aspirazione (8.500 x g a 4 °C per 10 minuti), seguita da un'ultima fase di centrifugazione e aspirazione, dopodiché il pellet AuNR-AV viene sospeso in 40 μL di PBS.
- Miscelare questa sospensione AuNR-AV con 10 μL di anticorpo biotinilato (0,5 mg/mL) specifico per un antigene sulla superficie del sottotipo di esosoma di interesse e 150 μL di PBS, quindi miscelare a 4 °C per 2 ore utilizzando un miscelatore per consentire il completamento del legame neutravidina-biotina.
- Lavare tre volte le AuNR coniugate con anticorpi risultanti (AuNR-IgG) mediante centrifugazione e aspirazione (6.500 x g a 4 °C per 10 minuti), quindi sospenderle in 200 μL di PBS e conservarle a 4 °C fino all'uso.
nota: Per evitare la contaminazione e la degradazione delle AuNR-IgG devono essere utilizzati una tecnica sterile e tempi di conservazione brevi. È meglio utilizzare AuNR coniugati con anticorpi entro 24 ore dalla loro coniugazione.
2. Preparazione delle diapositive di acquisizione EV
- Diluire gli anticorpi di cattura dell'esosoma selezionati a 0,025 mg/mL in PBS e aggiungere 1 μL/pozzetto di questa diluizione su un vetrino di proteina A/G multipozzetto, quindi incubare questo vetrino a 37 °C per 1 ora in una camera umidificata per consentire il legame degli anticorpi di cattura alla proteina A/G immobilizzata sul vetrino.
- Aspirare i pozzetti per rimuovere gli anticorpi non legati e lavarli tre volte mediante l'aggiunta e l'aspirazione di 1 μL/pozzetto di PBS. Quindi, caricare ogni pozzetto con 1 μL di tampone bloccante (vedere la Tabella dei materiali) e incubare il vetrino per 2 ore a 37 °C in una camera umidificata per bloccare eventuali siti di legame proteici rimanenti.
- Aspirare i pozzetti per rimuovere il tampone bloccante, lavare i pozzetti tre volte con l'aggiunta e l'aspirazione di 1 μL/pozzetto di PBS e utilizzare immediatamente i vetrini ostruiti per la cattura e l'analisi degli esosomi.
3. Preparazione della curva standard
- Per quantificare con precisione l'abbondanza assoluta o relativa di uno specifico sottotipo di esosoma, l'utente deve generare una curva standard con una popolazione di esosomi puri che esprima uniformemente il biomarcatore di superficie dell'esosoma di interesse. Questo studio analizza l'abbondanza di esosomi che esprimono una proteina di membrana associata alle metastasi, il recettore dell'efrina A2, che ha una relazione riportata con lo stadio e la prognosi del cancro del pancreas><.
nota: La linea cellulare di cancro del pancreas umano PANC-1 e i suoi esosomi sono noti per esprimere questa proteina e gli esosomi isolati da questa linea cellulare sono stati utilizzati per generare una curva standard per quantificare il numero di esosomi che esprimono questa proteina in campioni di esosomi complessi.
- Colture di cellule per 48 ore a 37 °C in terreni di coltura privi di siero per consentire l'accumulo di esosomi nei terreni, quindi isolamento dei surnatanti delle colture cellulari mediante centrifugazione di colture in sospensione o aspirazione diretta dei terreni di coltura da colture cellulari aderenti.
- Centrifugare il terreno raccolto a 2000 x g per 30 minuti per rimuovere i detriti e recuperare il surnatante.
- Filtrare il surnatante di coltura chiarificato attraverso un'unità filtrante a basso legame proteico da 0,45 μm di capacità appropriata (ad esempio, un'unità di filtrazione sottovuoto in polietere sulfone da 250 mL).
- Concentrare il filtrato risultante mediante centrifugazione a 3200 x g utilizzando un sistema di filtraggio con limite di peso molecolare nominale di 100.000 fino a un volume finale di 250 μl. Raccogliere il volume trattenuto da questo filtro, quindi lavare il filtro con 200 μL di PBS e combinare questo volume di lavaggio con il volume del campione di esosoma raccolto.
- Centrifugare questo campione a 21.000 x g per 45 minuti e recuperare con cura il surnatante, facendo attenzione a non raccogliere materiale precipitato.
- Centrifugare il surnatante recuperato a 100.000 x g per 3 ore per precipitare gli esosomi. Aspirare il surnatante e raccogliere il pellet di esosoma in 100 μl di PBS.
- Conservare le sospensioni esosomiche risultanti a 4 °C se utilizzate entro 24 ore o a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Non sottoporre i campioni di esosomi a cicli di congelamento-scongelamento ripetuti.
- Quantificare un'aliquota della sospensione dell'esosoma dopo la miscelazione mediante misurazione diretta del numero di esosomi (ad esempio, mediante analisi di tracciamento di nanoparticelle o rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili o misurazione della concentrazione proteica dei lisati di esosomi mediante saggio dell'acido micro-bicinchoninico, o un metodo equivalente, come mezzo per approssimare la quantità di esosomi).
- Generare una serie di diluizioni seriali della sospensione dell'esosoma per consentire il confronto del segnale delle nanoparticelle con il numero di esosoma in ingresso o il contenuto proteico.
- Trasferire 1 μL di ogni standard di esosoma in ciascuno dei suoi pozzetti replicati sulla piastra del saggio.
NOTA: Le curve standard possono essere utilizzate per calcolare la pendenza della linea di correlazione tra il segnale delle nanoparticelle e la concentrazione di esosomi per (1) valutare le prestazioni del saggio e (2) determinare la concentrazione relativa degli esosomi target nei campioni sperimentali.
4. Elaborazione di campioni di plasma o siero umano
- Raccogliere campioni di plasma o siero con metodi standard e conservarli a -80 °C fino al momento del bisogno per l'analisi degli esosomi. Scongelare rapidamente i campioni in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Mescolare ripetutamente i campioni scongelati mediante inversione per promuovere una sospensione omogenea.
NOTA: I risultati dei campioni di siero e plasma potrebbero non essere equivalenti poiché vi è un rilascio significativo di esosomi durante la reazione di coagulazione.
- Centrifugare campioni di plasma o siero a 500 x g per 15 minuti per precipitare aggregati proteici e altri detriti. Trasferire un'aliquota del campione di plasma o siero in una nuova provetta e aggiungere PBS per generare una diluizione 1:1. Miscelare il campione diluito mediante vortice o inversione delicata, a seconda dei casi. Trasferire 1 μl di ciascuna sospensione plasmatica o sierica in ciascuno dei suoi pozzetti replicati sulla piastra del saggio.
5. Cattura e rilevamento degli esosomi
- Caricare i pozzetti di un vetrino di cattura EV ostruito con 1 μL/pozzetto di campione di esosoma, utilizzando 8 repliche per campione, e incubare il vetrino per una notte a 4 °C in una camera umidificata. Aspirare tutti i pozzetti del campione e quindi aggiungere 1 μL/pozzetto di PBS per lavare i pozzetti e rimuovere gli esosomi non legati e altri contaminanti dal campione di esosomi caricato.
- Caricare i pozzetti del campione con 1 μL/pozzetto di una sospensione di AuNR-IgG precedentemente preparata (vedere la sezione 1 sopra) e incubare il vetrino per 2 ore a 37 °C in una camera umidificata. Aspirare la soluzione di nanoparticelle e lavare il vetrino in PBS integrato con 0,01% Tween-20 (PBST) per 10 minuti utilizzando un miscelatore, quindi aspirare e lavare tutti i pozzetti del campione con acqua deionizzata per 10 minuti utilizzando un miscelatore rotante e asciugare all'aria per le successive immagini LMDFM.
NOTA: I coefficienti di variazione (CV) tra i saggi sono valutati da otto repliche dello stesso campione. I campioni che presentano CV >20% sono considerati non informativi e devono essere ripetuti, se il campione è sufficiente.