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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei CTC
- Calcolare il numero di CTC necessarie per l'iniezione e preparare una sospensione monocellulare a 1,0 × 104 cellule/μL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Posizionare la sospensione cellulare su ghiaccio o a 4 °C per tutta la durata della procedura.
nota: Quando si utilizzano linee cellulari che richiedono la tripsinizzazione, assicurarsi di lavare le cellule due volte con PBS sterile per rimuovere la tripsina. Eseguire la conta delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Se viene utilizzata una coorte numerosa (>50 topi), contare le cellule e convalidare la vitalità cellulare tra le iniezioni per garantire che venga somministrato un numero costante di cellule per topo.
2. Procedura prechirurgica
- Iniettare nel topo per via sottocutanea 5 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (Bup-SR).
nota: Non iniettare l'area dell'incisione proposta; Scegliere un sito di iniezione ben lontano dalla scapola.
- Anestetizzare il topo con isoflurano al 2-3% fino a quando non mostra segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare la coda e/o il riflesso di pizzicamento della zampa per confermare lo stato di anestesia.
- Preparare il mouse per l'intervento chirurgico in una posizione lontana dall'area operatoria. Tagliare il sito chirurgico (cioè la superficie dorsale del cranio) con un'area di bordo sufficiente per evitare che la pelliccia contamini il sito di incisione; Quindi, saturare il sito con un antisettico germicida per la pelle, lavorando dal centro del sito alla periferia, quindi lasciare asciugare. Applicare un telo sterile o un materiale di plastica sterile con retro adesivo per proteggere il sito chirurgico dalla contaminazione.
nota: Gli strumenti devono essere sterilizzati in autoclave in anticipo e i puntali devono essere risterilizzati tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore a microsfere di vetro.
- Radere il pelo di tutta la superficie ventrale della testa e preparare la pelle utilizzando la tecnica sterile.
- Posizionare il naso con un cono a forma di L modificato dell'apparato stereotassico, assicurandosi che le narici rimangano libere e aperte. Usando del nastro adesivo sulle superfici ventrali di entrambi i padiglioni auricolari, tirare delicatamente la pelle in avanti per fissarla al cono del naso e piegare il collo con un angolo di circa 90° una volta fissato. Somministrare isoflurano all'1,5% per mantenere l'anestesia.
nota: Il corretto posizionamento farà sì che l'area dell'incisione venga presentata in modo da consentire una facile identificazione della cresta caudale dell'osso occipitale.
- Posiziona il corpo in modo che la colonna vertebrale sia mantenuta a livello della cisterna magna e, mentre applichi una leggera trazione alla coda, posiziona del nastro adesivo alla base della coda per fissarla.
3. Iniezione chirurgica di Cisterna Magna
- Con il collo in piena estensione, e iniziando appena tra i padiglioni auricolari, far scorrere le punte delle forbici chirurgiche verso il basso con una leggera pressione sull'osso occipitale><.
nota: In questa posizione della linea mediana, si nota una piccola depressione quando le punte delle forbici si immergono nell'area concava sopra la cisterna magna.
- Praticare una piccola incisione della linea mediana di 3-5 mm appena sopra la concavità palpata. Aspirare 5 μl di sospensione cellulare a 1,0 × 104 cellule/μl (totale 5,0 × 104 cellule) in una siringa Hamilton da 30 G.
- Utilizzare una pinza a punta smussata con punte da 1-2 mm per premere delicatamente sulla cisterna magna. Introdurre le punte in posizione chiusa e aprirle esercitando una pressione verso il basso sulla dura.
- Ripetere la dissezione smussata descritta nel passaggio precedente fino a quando la membrana durale non è facilmente identificabile e i vasi sanguigni associati sono visibili nell'area esposta.
nota: La finestra di iniezione risultante assicura che i vasi sanguigni non vengano danneggiati durante l'inserimento dell'ago.
- Tenendo la pinza aperta per ritrarre la muscolatura circostante, introdurre un ago non carotante da 30 G sotto la dura madre per visualizzare lo smusso. Assicurarsi che l'ago venga introdotto solo appena oltre lo smusso stesso. Aprire lentamente uno stantuffo della siringa ed erogare le cellule appena sotto la dura.
- Posizionare correttamente lo smusso per osservare l'iniezione sotto la dura. Somministrare con cura la tecnica e utilizzare l'ago senza carotaggio da 30 G per evitare danni alla membrana e garantire perdite minime. Se si notano perdite, applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone.
- Chiudere la pelle applicando una clip per ferite o una micro-goccia di adesivo cutaneo. Una volta eseguita con successo l'iniezione, lasciare che i topi si riprendano dall'anestesia su una coperta calda, osservandoli continuamente fino a quando non riescono a mantenere la posizione sternale e a dimostrare un movimento intenzionale.
- Monitorare i topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per la prima settimana. Se un topo sembra provare dolore o angoscia, trattarlo con un'iniezione sottocutanea di 10 mg/kg di carprofene una volta ogni 12-24 ore per un massimo di 5 giorni in base alla consultazione e alla direttiva veterinaria. Lasciare che i topi si riprendano e monitorarli per almeno 48-72 ore prima di procedere al passaggio successivo.
nota: Bup-SR, somministrato preventivamente, durerà fino a 72 ore, quindi normalmente non sono necessari ulteriori analgesici. Tuttavia, agli animali verranno forniti ulteriori analgesici se necessario (se letargici, non mangiano, arruffati). Se un sito chirurgico sviluppa segni di infezione postoperatoria (ad es. arrossamento, gonfiore, dolorabilità, allodinia, iperalgesia, iperpatia o suppurazione) o se il topo sta proteggendo l'area interessata, sopprimere il topo. Se le cellule tumorali vengono iniettate con successo nel liquido cerebrospinale, la LMD e la progressione del tumore si svilupperanno nel SNC entro 1 o 2 settimane (a seconda dei tipi di CTC o della linea cellulare utilizzata) (Figura 1).
