Iniezione intracerebroventricolare nel topo: un metodo di somministrazione diretta di farmaci mediato da Ommaya per somministrare farmaci ai ventricoli cerebrali del cervello del topo

Abstract

Fonte: Law, V. et al. Un modello di xenotrapianto di Ommaya murino per studiare la terapia mirata diretta della malattia leptomeningea. (2021)

Questo video mostra l'iniezione intracerebroventricolare mediata da ommaya in un modello murino. Il metodo consente la somministrazione localizzata di potenziali farmaci candidati ed elude la barriera emato-encefalica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Assemblaggio e impianto dell'Ommaya murino

1. Preparazione della stazione
   1. Disinfettare la superficie della stazione. Posizionare una copertura blu sulla superficie e tenere a portata di mano tutti gli strumenti e le forniture sterilizzate indicati nella Figura 1.
2. Procedura prechirurgica
   1. Applicare l'analgesia (Bup-SR) e mantenere l'ambiente chirurgico sterile.
3. Impianto chirurgico di Ommaya murina
   1. Assemblare il dispositivo di iniezione di Ommaya murino utilizzando una porta di iniezione miniaturizzata da 25 G (diametro esterno 0,51 mm) e un disco distanziatore da 1 mm. Utilizzare un adesivo sterile cianoacrilato per garantire la penetrazione di circa 2,5 mm della cannula metallica nell'emisfero cerebrale destro (Figura 2A-C).
      nota: In questo laboratorio è stato sviluppato un prototipo di Ommaya di topo compatibile con la risonanza magnetica, che ha già entrambe le parti (porta di iniezione in miniatura e distanziatore) stampate in 3D insieme come un'unica unità (Figura 2D). La versione a unità singola è stata testata dalla risonanza magnetica e consente di risparmiare tempo eliminando la fase di assemblaggio.
   2. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2-3% fino a quando non ci sono segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, verificare la presenza di riflesso di pizzicamento della coda e/o della zampa per confermare lo stato di anestesia.
   3. Radere l'intera superficie ventrale della testa di pelo e preparare la pelle secondo la tecnica sterile. Posizionare il topo nell'apparato stereotassico con un cono nasale per continuare la somministrazione di isoflurano durante la procedura; ridurre l'isoflurano all'1,5%. Stringere delicatamente le barre auricolari per fissare la testa e applicare un lubrificante per gli occhi per coprire gli occhi del mouse.
   4. Praticare una piccola incisione cutanea (3 mm), seguita da una dissezione smussata dei tessuti sottocutanei sottostanti per esporre il cranio. Asciugare il cranio utilizzando bastoncini applicatori imbevuti di perossido di idrogeno con punta di cotone.
   5. Praticare un foro di fresatura nel cranio a 0,5 mm posteriormente e 1,1 mm lateralmente della bregma, il punto anatomico del cranio in cui la sutura coronale è intersecata perpendicolarmente dalla sutura sagittale (Figura 2A), nonché un foro di fresa di 0,9 mm per esporre la dura madre. Spostare il microtrapano da parte e incidere delicatamente l'osso che circonda immediatamente il foro della fresa prima di inserire una porta di iniezione (profondità di circa 2,5 mm), fissata al cranio utilizzando un adesivo sterile cianoacrilato. Sutura a stato attorno al punto di iniezione utilizzando suture di nylon 4-0 senza assorbanza in un modello di punto interrotto o sutura con cordino della borsa.
   6. Ospita i topi post-operatorio in gabbie individuali per il recupero dall'intervento chirurgico.
      nota: È possibile che l'Ommaya murino possa staccarsi quando più topi recuperati dall'intervento chirurgico sono alloggiati nella stessa gabbia, probabilmente a causa di costanti interazioni di manomissione. Si raccomanda che i topi impiantati di Ommaya murino siano alloggiati individualmente (o non più di 2 topi per gabbia) nel corso della sperimentazione di efficacia del farmaco.

2. Trattamento dell'Ommaya Mucosa

1. Dosaggio dei topi con l'Ommaya murino
   1. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2-3%, fino a quando non ci sono segni di riflesso raddrizzante. Inoltre, verificare la presenza di riflesso di pizzicamento della coda e/o della zampa per confermare il mantenimento dell'anestesia.
   2. Accedi all'Ommaya murino utilizzando un adattatore per iniezione e una siringa Hamilton. Usando una pinza, afferrare la parte superiore della porta di iniezione in miniatura e inserire delicatamente l'adattatore dell'iniettore della porta completamente nel setto della porta.
      nota: L'iniettore della porta perfora il setto della porta in modo da ridurre al minimo lo spazio morto e consentire un'iniezione controllata tramite una pompa a siringa motorizzata (Figura 3A). I trattamenti mirati/innovativi vengono iniettati a una velocità di flusso di 1 μL/min in anestesia. Il trattamento deve essere somministrato a intervalli specificati (giornalieri/settimanali) per una durata prestabilita (settimane/mesi), a discrezione del ricercatore><. Un volume compreso tra 3 e 7 μl è ottimale, poiché un volume <3 μl è inaffidabile e un volume >7 μl può causare troppa pressione. La dimensione della siringa di Hamilton può variare da 10 a 100 μl, a seconda del numero di topi in ciascun braccio di trattamento. Il precaricamento del volume appropriato nella siringa Hamilton eviterà la sostituzione ripetuta della siringa, riducendo così al minimo gli errori. È meglio dedicare 1 siringa di Hamilton per braccio di trattamento.
   3. Una volta effettuata l'iniezione, staccare l'ommaya murina dall'adattatore per l'iniezione della porta utilizzando una pinza e rimettere il topo nella gabbia per riprendersi dall'anestesia.

Risultati

Figura 1: Un esempio di configurazione di una workstation per l'esecuzione dell'impianto di Ommaya murino nei topi. (1) Macchina per anestesia a gas/vaporizzatore. (2) Telo sterile di carta blu che copre un supporto stereotassico. (3) Dispositivo stereotassico (supporto/palco, barre auricolari, cono nasale). (4) Microtrapano. (5) Lente d'ingrandimento con luce. (6) Stick applicatori sterili con punta in cotone con contenitore sterile per il risciacquo s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Disco distanziatore da 1 mm	Alzet, Durect Corporation	#0008670	Solo disco distanziatore
Sutura in nylon 4-0 Ethilon	Qualsiasi fornitore
Pompe a siringa automatiche	Pompe a siringa Harvard (o qualsiasi fornitore)	#70-4505	Pompa 11 Elite
Sterilizzatore di perline	Braintree Scientific Inc. (o qualsiasi fornitore)	#GER 5287-120V	Germinatore 500
Buprenorfina a rilascio prolungato (Bup-SR)	Zoopharm		Controllato dalla DEA
Adesivo sterile cianoacrilato	Qualsiasi fornitore
Sistema di anetesia per inalazione di gas	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Siringhe da microlitri Hamilton	Hamilton		10, 25, 50 e 100 μL; 30G per iniezione cisterna magna
Perossido di idrogeno	Qualsiasi fornitore
Sistema di imaging IVIS 200	Calibro per le scienze della vita
Lente d'ingrandimento con luce	Qualsiasi fornitore
Microtrapano	Stoelting (o qualsiasi fornitore)	#51555M
Imaging MRI	Bruker	Serie BioSpec	opzionale
Prototipo di Ommaya murina (compatibile con la risonanza magnetica)	Laboratori Instech, Inc.	#VAB620-25MRI-3.3
Iniettore PinPort	Laboratori Instech, Inc.	#PNP3M-50
Porta PinPort	Laboratori Instech, Inc.	#1-PNP3F28-50
Strumenti chirurgici per roditori (forbici, pinze)	Strumento chirurgico Roboz (o qualsiasi fornitore)
Dispositivo stereotassico	Stoelting (o qualsiasi fornitore)	#51730M
Copertura sterile in carta blu/telo	Qualsiasi fornitore
Bastoncini di cotone sterili	Qualsiasi fornitore