Modello di cellule staminali di glioma marcate con luciferasi: un metodo mediato da lentivirus per preparare cellule staminali di glioma marcate con luciferasi per studi terapeutici in vitro

Abstract

Fonte: Hu, Z. et al. Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare una potenziale terapia di combinazione per il GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate da pazienti. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra la creazione di cellule staminali di glioma marcate con luciferasi attraverso la consegna genica mediata da lentivirus. La luciferasi agisce come gene reporter e aiuta a facilitare gli esperimenti di screening rapido dei farmaci.

Protocollo

1. Preparazione di GSC marcate con Luciferasi

1. Iniziare con la coltura di GSC e centrifugare a 70 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere il surnatante e digerire le cellule con accutasi per 4 minuti a 37 °C. Utilizzare ripetutamente un puntale da 200 μl e pipettare per dissociare e risospendere il pellet cellulare.
3. Diluire le cellule a 2 x 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra di coltura a 12 pozzetti e coltivare le cellule durante la notte.
4. Aggiungere 30 μL di surnatante del virus luciferasi-EGFP (titolo >10⁸ TU/mL) in ciascun pozzetto della piastra, quindi centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 ore a 25 °C. Coltivare le cellule per una notte.
5. Rinfrescare il terreno il giorno successivo e coltivare le cellule per altre 48 ore.
6. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza per confermare l'aspetto delle cellule GFP-positive.
7. Utilizzare un selezionatore di celle a flusso per ordinare e selezionare le GSC con un'elevata fluorescenza GFP per coltivare ulteriormente le cellule.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B-27	Gibco	Codice 17504-044	50 volte
FEG	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasale	Gibco	21103049	1X
Penicillina-Streptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unità/ml S: 10.000 ug/ml
Piruvato di sodio	Gibco	2088876	100 mM