Saggio basato sulla bioluminescenza cellulare: un metodo ad alto rendimento per lo screening combinatorio di farmaci

Abstract

Fonte: Hu, Z. et al. Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare una potenziale terapia di combinazione per il GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate da pazienti.J. Vis. Exp.(2021)

In questo video, descriviamo un metodo che evidenzia l'utilità del saggio di bioluminescenza per lo screening sensibile e rapido dei farmaci. Questi farmaci possono essere testati da soli o in combinazione per valutare il sinergismo nel loro meccanismo d'azione.

Protocol

1. Misurazione della vitalità cellulare basata sulla bioluminescenza

1. Piastre di rivestimento con la miscela di matrice extracellulare (ECM) (ad es. Matrigel): aggiungere 40 μL di miscela ECM 0,15 mg/mL a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 1 ora a 37 °C. Rimuovere la miscela ECM in eccesso e risciacquare delicatamente una volta con PBS.
2. Aggiungere 100 μL di terreno di coltura contenente 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 e 500 cellule XG387-Luc insieme a 100 μL di terreno bianco come controllo in ciascun pozzetto per 6 repliche in una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti e coltivare le cellule durante una notte a 37 °C.
3. Rimuovere il surnatante, aggiungere 50 μL di terreno di coltura contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzetto e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C.
4. Scattare immagini della bioluminescenza cellulare nella lastra utilizzando il sistema di imaging a spettro IVIS. Utilizza il software integrato per creare più aree circolari della regione di interesse (ROI) e quantificare la bioluminescenza cellulare.

2. Trattamento con temozolomide e screening combinato

1. Prerivestire quattro piastre da 96 pozzetti come descritto sopra nella fase 1, prima del trattamento.
2. Seminare le cellule XG387-Luc a una densità di 1.000 cellule in un terreno di coltura da 100 μL in ciascun pozzetto di una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti e coltivare le cellule durante la notte.
3. Preparare in anticipo la temozolomide e gli agenti mirati dalla soluzione madre. Preparare una serie di concentrazioni composta da 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM e 50 μM di temozolomide in terreno di coltura per il trattamento con un singolo agente. Diluire la temozolomide e gli agenti mirati nella soluzione madre nel terreno di coltura, rispettivamente, per ottenere concentrazioni finali di 200 μM e 2 μM per lo screening di farmaci di combinazione (elenco dei materiali).
4. Rimuovere il terreno di coltura quando la maggior parte delle GSC aderisce al fondo delle piastre; aggiungere il terreno sopra preparato contenente temozolomide in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento.
5. Per trattare la temozolomide e per lo screening delle combinazioni di farmaci, rimuovere il terreno bianco e aggiungere il terreno sopra preparato contenente 200 μM di temozolomide o 2 μM di agente mirato, o una combinazione di entrambi in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento.
6. Incubare tutte le piastre a 37 °C, 5% CO₂ per 3 giorni.
7. Rimuovere il terreno contenente il farmaco, aggiungere 50 μL di terreno bianco contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzetto e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C.
8. Scattare immagini della bioluminescenza cellulare nella lastra utilizzando il sistema di imaging a spettro IVIS. Utilizza il software integrato per creare più ROI circolari e quantificare la bioluminescenza cellulare.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	Codice 17504-044	50 volte
FEG	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasale	Gibco	21103049	1X
Penicillina-Streptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unità/ml S: 10.000 ug/ml
Piruvato di sodio	Gibco	2088876	100 mM
ABT-737	MCE		Inibitore selettivo e mimetico BH3 di Bcl-2, Bcl-xL e Bclw
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Inibitore Wee1
Axitinib	MCE		Inibitore della tirosin-chinasi multi-target
AZD5991	MCE		Inibitore di Mcl-1
A 83-01	MCE		Potente inibitore della chinasi ALK5 del recettore del TGF-β tipo I
CGP57380	Selleck		Potente inibitore di MNK1
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Doppio inibitore ATPcompetitivo PI3K e mTOR
Dasatinib	MCE		Doppio inibitore della tirosin-chinasi della famiglia Bcr-Abl e Src
Erlotinib	MCE		Inibitore della tirosin-chinasi dell'EGFR
Gefitinib	MCE		Inibitore della tirosin-chinasi dell'EGFR
Linifanib	MCE		Inibitore multi-target della famiglia VEGFR e PDGFR
Masitinib	MCE		Inibitore di c-Kit
Codice: ML141	Selleck		Inibitore non competitivo della Cdc42 GTPasi
OSI-930	MCE		Inibitore multi-target di Kit, KDR e CSF-1R
Palbociclib	MCE		Inibitore selettivo di CDK4 e CDK6
SB 202190	MCE		Inibitore selettivo della chinasi p38 MAP
Bromuro di sepantronio (YM-155)	MCE		Inibitore della survivina
TCS 359	Selleck		Potente inibitore di FLT3
UMI-77	MCE		Inibitore selettivo di Mcl-1
4-idrossitamoxifene (afimoxifene)	Selleck		Modulatore selettivo del recettore degli estrogeni (ER)