Isolamento basato su SEC di vescicole extracellulari derivate da microglia: una tecnica per isolare vescicole extracellulari da terreni di coltura condizionati con microglia

Abstract

Fonte: Lemaire, Q. et al. Caratterizzazione delle vescicole extracellulari derivate da cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive un metodo basato sulla cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per isolare vescicole extracellulari o vescicole extracellulari derivate dalle cellule immunitarie cerebrali, la microglia. Le vescicole extracellulari agiscono come carico molecolare per fornire mediatori, che regolano una risposta immunitaria. Pertanto, le vescicole extracellulari isolate possono essere utilizzate come modello in vitro per studiare il crosstalk microglia-neurone durante una risposta immunitaria neuronale.

Protocol

1. Coltura primaria di microglia/macrofagi

1. Coltura primaria di microglia
   1. Coltura di microglia primarie di ratto commerciali (2 x 10⁶ cellule) (vedere la Tabella dei materiali) nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero privo di esosomi, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 9,0 g/L di glucosio a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Raccogliere il terreno condizionato dopo una coltura di 48 ore e procedere all'isolamento delle vescicole extracellulari.
2. Coltura primaria dei macrofagi
   1. Coltura di macrofagi primari di ratto commerciali (1 x 10⁶ cellule) nel terreno fornito dal produttore (vedere la Tabella dei materiali) a 37 °C e 5% di CO₂, con siero privo di esosomi.
   2. Raccogliere il terreno condizionato dopo una coltura di 24 ore e procedere all'isolamento delle vescicole extracellulari.

2. Isolamento delle EV

1. Pre-isolamento di vescicole extracellulari da mezzo condizionato
   1. Trasferire il terreno di coltura condizionato da colture di microglia o macrofagi (passaggi 1.1.2 o 1.2.2) in una provetta conica.
   2. Centrifugare a 1.200 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) per pellettare le celle.
   3. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico. Centrifugare a 1.200 x g per 20 minuti a RT per eliminare i corpi apoptotici.
   4. Trasferire il surnatante in una provetta in policarbonato da 10,4 mL e trasferire la provetta in un rotore da 70,1 Ti. Ultracentrifugare a 100.000 x g per 90 minuti a 4 °C per pellettare le EV.
   5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet contenente EVs in 200 μL di soluzione salina tampone fosfato filtrato (PBS) da 0,20 μm.
2. Isolamento dei veicoli elettrici
   1. Preparazione della colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)
      1. Svuotare una colonna cromatografica in vetro (lunghezza: 26 cm; diametro: 0,6 cm) (vedere la Tabella dei materiali), lavarla e sterilizzarla.
      2. Posizionare un filtro da 60 μm nella parte inferiore della colonna.
      3. Impilare la colonna con una matrice di base di filtrazione su gel di agarosio reticolato per creare una fase stazionaria di 0,6 cm di diametro e 20 cm di altezza.
      4. Sciacquare la fase con 50 mL di PBS filtrato da 0,20 μm. Conservare a 4 °C per essere utilizzato in seguito, se necessario.
   2. Posizionare il pellet EV risospeso sopra la fase stazionaria della colonna SEC.
   3. Raccogliere 20 frazioni sequenziali da 250 μl continuando ad aggiungere 0,20 μm di PBS filtrato sulla parte superiore della fase stazionaria per evitare l'essiccazione della colonna. Se necessario, conservare le frazioni a -20 °C.
      nota: È possibile eseguire una conservazione più lunga di una settimana a -80 °C per mantenere l'integrità delle vescicole extracellulari per l'analisi molecolare.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Terreno di coltura di macrofagi e microglia di ratto	Applicazioni cellulari	R620K-100	Origine cellulare: Ratto sano normale midollo osseo
Microglia primaria di ratto	Lonza	Motore RG535
Sefarosio CL-2B	GE Sanità	17014001
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Codice A95765
Rotore per ultracentrifuga 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
glucosio	Sigma-Aldrich	G8769
Soluzione salina tampone fosfato	Invitrogen	14190094	Senza calcio, senza magnesio
Provette da centrifuga in policarbonato	Beckman Coulter	355651
Penicillina-Streptomicina	Gibco	Codice: 15140-122
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	FBS impoverito dell'esosoma
DMEM Gibco 41966029
centrifuga	Eppendorf	5804000010
Incubatore a CO2	ThermoFisher
pluriFiltro M/ 60 μm	pluriSelect	43-50060
Colonna FPLC MonoP	GE Sanità		Non più disponibile