Estrazione basata su SDS-PAGE di proteine associate alle vescicole extracellulari: una procedura per estrarre proteine dalle vescicole extracellulari e prepararle per la digestione in gel

Abstract

Fonte: Lemaire, Q. et al. Caratterizzazione delle vescicole extracellulari derivate da cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo il metodo di digestione in-gel SDS-PAGE per l'estrazione di proteine da vescicole extracellulari o EV. Una volta isolati, i frammenti proteici ottenuti possono essere utilizzati per l'analisi proteomica.

Protocollo

1. Caratterizzazione delle EV

1. Analisi del Western Blot
   1. Estrazione delle proteine
      1. Isolare le vescicole extracellulari mediante colonna cromatografica ad esclusione dimensionale (SEC) e quantificarle utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).
      2. Miscelare 50 μL di tampone RIPA (150 mM di cloruro di sodio [NaCl], 50 mM di Tris, 5 mM di glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico [EGTA], 2 mM di acido etilendiammino-tetraacetico [EDTA], 100 mM di fluoruro di sodio [NaF], 10 mM di pirofosfato di sodio, 1% Nonidet P-40, 1 mM di fenilmetanosulfonilfluoruro [PMSF], 1x inibitore della proteasi) con il campione EV (25 μL risultante dalla concentrazione di EV sul filtro) per 5 minuti su ghiaccio estrarre proteine.
      3. Sonicare per 5 s (ampiezza: 500 W; frequenza: 20 kHz), 3 volte sul ghiaccio.
      4. Rimuovere i detriti vescicolari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 10 minuti, a 4 °C.
      5. Raccogliere il surnatante e misurare la concentrazione proteica con il metodo del saggio proteico Bradford.
   2. Elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e western blotting
      1. Mescolare estratti proteici (30 μg) con un tampone campione di Laemmli 5c (v/v).
      2. Caricare la miscela proteica su un gel di poliacrilammide al 12%.
      3. Migrare le proteine nel gel con il tampone TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM glicina e 0,1% SDS), a 70 V per 15 minuti e 120 V per 45 minuti.
      4. Trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa con sistema semisecco a 230 V per 30 min.
      5. Saturare la membrana per 1 ora a RT con tampone bloccante (0,05% Tween 20 p/v, 5% latte in polvere p/v in 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Incubare la membrana per una notte a 4 °C con l'anticorpo monoclonale di topo anti-shock termico umano 90 (HSP90) diluito in tampone bloccante (1:100).
      7. Lavare la membrana tre volte con PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 p/v) per 15 minuti.
      8. Incubare la membrana per 1 ora a RT con l'anticorpo secondario anti-IgG di topo coniugato con perossidasi di rafano di capra diluito in tampone bloccante (1:10.000).
         NOTA: Un controllo negativo viene eseguito utilizzando solo l'anticorpo secondario.
      9. Ripetere la fase di lavaggio (passaggio 1.1.2.7).
      10. Rivelare la membrana con il kit di substrato per western blotting a chemiluminescenza potenziata (ECL) (vedere la tabella dei materiali).

2. Analisi proteomica

1. Estrazione delle proteine e digestione in gel
   1. Isolare le vescicole extracellulari mediante colonna cromatografica ad esclusione dimensionale (SEC) e quantificarle utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Ripetere il passaggio 1.1.1 per l'estrazione delle proteine EV.
   2. Eseguire la migrazione delle proteine nel gel di impilamento di un gel di poliacrilammide al 12%.
   3. Fissare le proteine nel gel con Coomassie blue per 20 minuti a RT.
   4. Acciuffare ogni pezzo di gel colorato e tagliarlo a pezzetti di 1 mm³.
   5. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 μL di ciascuna soluzione: acqua ultrapura per 15 minuti, acetonitrile al 100% (ACN) per 15 minuti, 100 mM di bicarbonato di ammonio (NH₄HCO₃) per 15 minuti, ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) per 15 minuti e ACN al 100% per 5 minuti con agitazione continua.
   6. Asciugare completamente i pezzi di gel con un concentratore sottovuoto.
   7. Eseguire la riduzione delle proteine con 100 μL di 100 mM NH₄HCO₃ contenente 10 mM di ditiotreitolo per 1 ora a 56°C.
   8. Eseguire l'alchilazione delle proteine con 100 μL di 100 mM NH₄HCO₃ contenente 50 mM di iodoacetamide per 45 minuti al buio a RT.
   9. Lavare i pezzi di gel in successione con 300 μL di ciascuna soluzione: 100 mM di NH₄HCO₃ per 15 minuti, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) per 15 minuti e ACN al 100% per 5 minuti con agitazione continua.
   10. Asciugare completamente i pezzi di gel con un concentratore sottovuoto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acetonitrile	Prodotti chimici Fisher	Pannello A955-1
Bicarbonato di ammonio	Sigma-Aldrich	Codice: 9830
Anticorpo HSP90 α/β (RRID: AB_675659)	Babbo Natale	SC-13119
Concentrato di reagenti colorante per il saggio delle proteine Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	Numero 43819
Acido etilenglicole-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'- tetraacetico	Sigma-Aldrich	Codice 03777-10G
Acido etilendiamminatetraacetico	Sigma-Aldrich	ED-100G
Fisherbrand Sonicatore Q500 con sonda	Fisherbrand	12893543
Idoacetammide	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Spedizione	ISB1L
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka	Codice: 56741
Perossidasi AffiniCapra Pura AntiIgG di Topo (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Codice 115-035-003
Coniugato falloidina-tetrametilrodamina	Babbo Natale	SC-362065
Inibitore della proteasi	Sigma-Aldrich	S8830-20SCHEDA
cloruro di sodio	Scharlau	SO0227
Sodio Dodecil Solfato	Sigma-Aldrich	L3771
Fluoruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Pirofosfato di sodio	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentratore a vuoto SpeedVac	ThermoFisher
Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940