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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Impianto di cellule tumorali e preparazione della finestra di imaging cranico
- Preparazione chirurgica
- Usa topi adulti (>6 settimane) di qualsiasi ceppo o sesso. Sedare un topo iniettando fluanisone [neurolettico] + fentanil [oppioide]) (0,4 ml/kg) + benzodiazepine sedativo (2 mg/kg) alla dose di 1:1:2 in acqua sterile. Valutare lo stato di sedazione dell'animale pizzicando le dita dei piedi.
nota: In questo protocollo, sono stati utilizzati sia topi femmine che maschi C57BL/6 a causa dello stesso background genetico della linea cellulare tumorale utilizzata in questi esperimenti (GL261). Il mouse rimarrà completamente sedato per 1,5 ore. In alternativa, utilizzare un'anestesia per inalazione come l'isoflurano (miscela 1,5%-2% di isoflurano/O2).
- Monta il mouse su un telaio stereotassico e fissa la testa utilizzando un morsetto per il naso e due barre auricolari.
- Utilizzare una lampada riscaldante per preservare la temperatura corporea. La lampada riscaldante deve essere utilizzata con cautela, in alternativa è possibile utilizzare cuscinetti riscaldanti a ricircolo d'acqua.
- Applicare un unguento per gli occhi per proteggere le cornee del topo dalla secchezza.
- Usa le forbici affilate per radere il pelo del cranio (area dorsale dagli occhi del topo alla base del cranio) e disinfetta la pelle esposta con etanolo al 70%.
- Tagliare la pelle in modo circolare con forbici affilate e raschiare via il periostio sottostante con un batuffolo di cotone. Applicare una goccia di lidocaina 1% + epinefrina 1:100.000 per 5 minuti e rimuovere l'eccesso con un batuffolo di cotone.
- Incolla i bordi della pelle al cranio con colla cianoacrilica.
- Posizionare la montatura stereotassica sotto uno stereomicroscopio da dissezione con ingrandimento 4x.
- Visualizza il cranio attraverso il microscopio da dissezione e pratica un solco circolare di 5 mm di diametro sopra l'osso parietale destro. Eseguire questo passaggio con attenzione e solo superficialmente, evitando qualsiasi pressione sul cranio.
- Applicare una goccia di tampone corteccia (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucosio, 10 mM tampone HEPES, 2 mM MgSO4 e 2 mM CaCl2 [pH 7,4]) e sollevare il lembo osseo utilizzando una pinza sottile.
- Per i passaggi successivi, mantenere la superficie cerebrale coperta con un tampone della corteccia se non diversamente indicato.
- Al microscopio da dissezione, visualizzare la superficie cerebrale e rimuovere la dura madre utilizzando una pinzetta curva, affusolata e a punta molto fine. Se si verifica un'emorragia in questa fase, utilizzare una spugna di gelatina assorbibile per fermarla.
2. Preparazione della finestra di imaging cranico
- Rimuovere il tampone della corteccia e posizionare una goccia di olio di silicone sul sito della craniotomia per evitare bolle d'aria sotto la finestra.
- Sigillare il cervello esposto con un vetrino coprioggetti da 6 mm. Applicare la colla cianoacrilica tra il vetrino coprioggetti e il cranio. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti contro il cranio con l'aiuto di una pinzetta sottile per garantire una distanza minima tra il cervello e il vetrino coprioggetti.