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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Imaging intravitale
NOTA: L'intervallo di tempo tra l'iniezione di cellule tumorali e la prima sessione di imaging intravitale dipende dal tipo di linea cellulare tumorale utilizzata. Per gli esperimenti mostrati in questo protocollo, sono state iniettate 1x 105 cellule GL261 e sono state acquisite 10 giorni dopo.
- Preparazione all'imaging
- Sedare il topo utilizzando l'anestesia per inalazione di isoflurano attraverso una maschera facciale (miscela di isoflurano/O2 all'1,5%-2%).
- Iniettare nel topo per via sottocutanea 100 μL di tampone salino per prevenire la disidratazione.
nota: Per l'imaging a lungo termine, il topo può essere idratato attraverso una pompa per infusione sottocutanea.
- Posizionare il mouse a faccia in su in una casella di imaging. Utilizzare una piastra metallica con un foro di 1 mm di diametro e piccoli magneti incorporati attorno all'apertura per fornire il fissaggio del CIW alla scatola di imaging. Introdurre l'isoflurano attraverso una maschera facciale e ventilare da un'uscita sull'altro lato della scatola (miscela 0,8%–1,5% di isoflurano/O2). Facoltativamente, utilizzare del nastro adesivo per fissare il corpo del mouse.
nota: A questo punto il destrano marcato in fluorescenza per la visualizzazione dei vasi sanguigni o altri coloranti possono essere iniettati per via endovenosa.
- Opzionalmente, utilizzare un pulsossimetro e una sonda di riscaldamento per monitorare i parametri vitali del mous.
nota: In questo esperimento, non è stato necessario utilizzare un pulsossimetro e una sonda di riscaldamento poiché il topo è rimasto stabile per tutto il periodo di imaging (2-3 ore). Tuttavia, per tempi di imaging più lunghi, potrebbe essere necessario un monitoraggio più approfondito.
- Impostare l'obiettivo dell'acqua 25x (ad es. HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) sulla posizione z più bassa e aggiungere una grande goccia d'acqua.
nota: L'uso di un microdispenser ad immersione in acqua è altamente consigliato per esperimenti a lungo termine poiché consente agli scienziati di aggiungere acqua durante l'esperimento. In alternativa, è possibile utilizzare un obiettivo a secco.
- Trasferire la scatola di imaging sul microscopio dotato di una camera climatica buia mantenuta a 37 °C. Portare l'obiettivo sul vetrino coprioggetti CIW fino a quando la goccia d'acqua non lo tocca.
- Utilizzando la modalità di epifluorescenza, osservare il tumore attraverso l'oculare e mettere a fuoco le cellule.
2. Acquisizione di immagini in time-lapse
- Seleziona diverse posizioni di interesse per l'immagine e registra le loro coordinate nel software. Assicurarsi che le posizioni selezionate siano posizioni rappresentative di diversi siti del tumore (ogni tumore può essere diverso, ma per garantire la coerenza, selezionare la stessa quantità di posizioni che sono centrali per il nucleo del tumore e per i bordi in tutti i topi).
nota: Può essere eseguita una scansione a piastrelle di una parte del tumore o dell'intero tumore visibile; Tuttavia, se il tumore è grande, questo metodo aumenterà il lasso di tempo tra le immagini. Inoltre, se le cellule tumorali si muovono velocemente, può essere difficile tracciare le stesse cellule nel tempo.
- Passa alla modalità multifotone e sintonizza il laser sulla lunghezza d'onda corretta. Si noti che per evitare fotodanneggiamento, si desiderano lunghezze d'onda più elevate.
nota: Per l'imaging Dendra2 è stata utilizzata una lunghezza d'onda di 960 nm. Con l'obiettivo utilizzato in questi esperimenti, uno zoom di 1,3 è stato sufficiente per ottenere una buona risoluzione dei nuclei tumorali e scansionare un'area rappresentativa del tumore.
- Vai alla modalità live e definisci uno z-stack per ogni posizione al fine di acquisire il volume massimo di cellule tumorali senza compromettere la risoluzione delle cellule tumorali. Definisci la dimensione del passo tra le immagini come 3 μm.
- Utilizzare la modalità bidirezionale per aumentare la velocità di scansione. La risoluzione dell'immagine deve essere di almeno 512 x 512 pixel.
- Acquisire immagini del volume tumorale in diverse posizioni ogni 20 minuti per 2 ore. Aggiungere acqua all'obiettivo prima di ogni acquisizione di immagini.
nota: Le immagini time-lapse possono essere acquisite automaticamente impostando il time-lapse corretto nel software. Tuttavia, il mouse può muoversi e la posizione o lo z-stack possono spostarsi nel tempo, causando la perdita di dati. Pertanto, si consiglia di eseguire manualmente il time-lapse e di controllare e regolare gli spostamenti xyz tra le acquisizioni.
- A questo punto, facoltativamente, fotocambiare il marcatore fluorescente Dendra2.
nota: A differenza dell'imaging time-lapse (che consente di studiare le proprietà delle singole cellule tumorali e il modo in cui cambiano nel tempo), questo consentirà di studiare l'area di infiltrazione delle cellule tumorali nel cervello per diversi giorni.