1. Saggio di attrazione dei macrofagi in vitro
- Preparazione di terreni condizionati
- Riscaldare il terreno di mantenimento delle cellule tumorali a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti.
- Spruzzare la superficie della cappa di coltura tissutale con etanolo al 70% e rimuovere l'etanolo al 70% dalla superficie con carta assorbente. Prelevare la soluzione per il distacco delle cellule dal frigorifero. Spruzzare i flaconi del terreno e la soluzione di distacco cellulare con etanolo al 70%, rimuovere l'etanolo al 70% sulla superficie con carta assorbente e inserirli nella cappa di coltura tissutale.
- Estrarre le piastre a 6 pozzetti dall'incubatore. Pipettare con cura il terreno condizionato in provette da centrifuga sterili da 15 mL. Metti i tubi sul ghiaccio. Pipettare il terreno nel pozzetto "solo terreno" in una provetta da centrifuga sterile separata da 15 ml.
NOTA: Prima di questo passaggio, assicurati di controllare al microscopio per vedere se le cellule si attaccano. In caso contrario, è possibile utilizzare piastre rivestite per consentire un migliore fissaggio o includere le celle flottanti nella fase di conteggio.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione di distacco cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Controlla se le cellule tumorali si arrotondano ogni minuto. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, picchiettare delicatamente il lato della placca per aiutare le cellule a staccarsi.
- Pipettare 2,5 mL di terreno di mantenimento delle cellule tumorali nel pozzetto, pipettare su e giù 3 volte per miscelare e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Prelevare 10 μL di cellule e mescolarle con 10 μL di soluzione di Trypan Blue. Pipettare 10 μl della miscela nel vetrino di conteggio e quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore automatico di cellule.
- Regolare il volume del terreno condizionato in base al numero di cellule utilizzando il terreno di coltura con cellule staminali libere nel siero (incubazione a 37 °C durante la notte). Ad esempio, se il pozzetto A ha un numero di cellule vive 3 volte superiore a quello con il minor numero di cellule, diluire il suo terreno condizionato 1:3. Questo passaggio viene utilizzato per controllare la differenza causata dal tasso di proliferazione cellulare.
nota: Il motivo per utilizzare il terreno di cellule staminali libere di siero con incubazione notturna a 37 °C è quello di controllare il possibile cambiamento del terreno con un'esposizione prolungata a 37 °C.
- Filtrare il mezzo condizionato attraverso filtri da 0,45 μm. Metti il supporto condizionato sul ghiaccio.
NOTA: Questa fase rimuove le cellule e i detriti cellulari nel terreno condizionato.
2. Preparazione delle celle MV-4-11
- Riscaldare il fluido IMDM (senza FBS) a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti.
- Spruzzare la superficie della cappa di coltura tissutale con etanolo al 70% e rimuovere l'etanolo al 70% dalla superficie con carta assorbente. Spruzzare il flacone del terreno con etanolo al 70%, rimuovere l'etanolo al 70% sulla superficie con carta assorbente e inserirlo nella cappa di coltura tissutale.
- Inserire il pallone di cellule MV-4-11 nella cappa di coltura tissutale. Pipettare 10 mL di cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Prelevare 10 μL di cellule e mescolarle con 10 μL di soluzione di Trypan Blue. Pipettare 10 μl della miscela nel vetrino di conteggio e quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore automatico di cellule. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante.
- Lavare le cellule con 10 mL di PBS e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in terreno IMDM (senza FBS) per una densità cellulare finale di 1x106 cellule/mL.
NOTA: Il numero di celle dei macrofagi utilizzati qui può essere regolato.
3. Saggio Transwell
NOTA: Per questo passaggio, utilizzare un kit di test di migrazione cellulare o acquistare i reagenti e inserirli separatamente. Per le celle MV-4-11, scegliere gli inserti Transwell con pori di 5 μm. Per rilevare la migrazione dei macrofagi, quantificare direttamente il numero di macrofagi nella camera inferiore o utilizzare metodi colorimetrici/fluorimetrici. Qui, dimostriamo il test utilizzando il metodo colorimetrico.
- Portare la piastra a 24 pozzetti, l'inserto e i reagenti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 250 μl di cellule MV-4-11 preparate sopra in ciascun inserto.
- Aggiungere 400 μl di solo terreno/terreno condizionato (con incubazione notturna a 37 °C, questi campioni fungono da controllo negativo) nelle camere inferiori della piastra a 24 pozzetti. Per ogni linea tumorale o controllo, utilizzare campioni in triplice copia. Evitare la formazione di bolle tra l'inserto e il fluido condizionato. Le bolle inibiscono la migrazione dei macrofagi verso i pozzetti sul fondo.
- Incubare le piastre in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5% per 4 h.
NOTA: Il tempo di incubazione può essere regolato. Le cellule che migrano nelle camere inferiori possono essere viste al microscopio.
- Picchiettare delicatamente l'inserto sulla parete interna dello stesso pozzetto ed eliminare l'inserto. Poiché le cellule MV-4-11 crescono in sospensione, la soluzione di distacco cellulare o il trattamento con tripsina non sono necessari.
- Pipettare delicatamente le cellule nei pozzetti su e giù 3 volte per mescolare. Trasferire 225 μl di sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti a parete nera adatta per la misurazione fluorescente.
- Diluire il colorante CyQuant 1:75 con 4x tampone di lisi. Agitare brevemente e far girare la soluzione. Aggiungere 75 μl di soluzione a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
- Lettura della fluorescenza utilizzando il set di filtri 480/520 nm con lettore di piastre a fluorescenza.
- Analizza i dati sottraendo il bianco e normalizzandoli alla linea cellulare tumorale di controllo.
