Estrazione di vescicole extracellulari: una tecnica per isolare le vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero utilizzando la centrifugazione differenziale

Abstract

Fonte: Hurwitz, S. N. et al. Estrazione di Vescicole Extracellulari da Tessuto Intero. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive la tecnica di estrazione di vescicole extracellulari da tessuti freschi o congelati. Le vescicole extracellulari isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi per scoprire il loro ruolo significativo nella patogenesi della malattia.

Protocollo

1. Dissociazione tissutale e centrifugazione differenziale

1. Preparare 10 mL di tampone di dissociazione (10 mg di papaina; 5,5 mM di L-cisteina; 67 μM di 2-mercaptoetanolo; 1,1 mM di EDTA) in terreno ibernato-E per circa 0,4-1,0 g di tessuto.
   NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate per l'arricchimento e la purificazione delle vescicole extracellulari devono essere diluite in acqua filtrata ultrapura.
2. Aggiungere il tessuto intero, fresco o congelato, al tampone di dissociazione in una provetta conica da 50 mL e incubare in un bagno di acqua calda a 37 °C per 20 minuti. Se necessario, il tessuto può essere tagliato in frammenti più piccoli prima dell'incubazione.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere inibitori della proteasi e della fosfatasi per una concentrazione finale di 1x al tampone di dissociazione contenente il tessuto.
4. Versare la soluzione contenente il tessuto in un omogeneizzatore Dounce a montaggio largo e dissociare delicatamente il tessuto utilizzando circa 30 colpi lenti per campione. Il numero di corse può essere regolato in base alla consistenza del tessuto.
5. Trasferire il tessuto dissociato in tampone in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule e i frammenti di tessuto fibrosi o coesivi rimanenti.
6. Trasferire il surnatante in una provetta conica pulita da 50 ml e centrifugare a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare e scartare i detriti cellulari di grandi dimensioni.
7. Trasferire nuovamente il surnatante in una provetta conica pulita da 50 ml e centrifugare a 10.000 x g per 40 minuti a 4 °C per pellettare vescicole più grandi indesiderate o piccoli corpi apoptotici.
   NOTA: Questo pellet può essere conservato per ulteriori studi di vescicole più grandi, se lo si desidera.
8. Decantare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 μm in una provetta per ultracentrifugazione da 12 mL pulita.
   nota: I campioni di tessuto densamente fibrotico potrebbero non essere facilmente filtrati. Questi campioni possono essere filtrati attraverso un filtro cellulare da 40 μm, quindi fatti passare attraverso aghi seriali più piccoli (18 G, 20 G, 22 G) prima di essere filtrati attraverso il filtro da 0,45 μm.
9. Ultracentrifugare il campione a 100.000 x g per 2 ore a 4 °C per pellettare piccole EV.
10. Decantare il surnatante e lasciare le provette per ultracentrifugazione capovolte per 5-10 minuti, picchiettando frequentemente per rimuovere il liquido residuo sui lati delle provette. Il fluido residuo può anche essere aspirato utilizzando una pipetta a vuoto aspirante.
11. Risospendere il pellet EV in 1,5 mL di tampone saccarosio 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). In questa fase è importante garantire la completa risospensione del pellet. Per fare ciò, coprire i tubi con parafilm prima di far vorticare le vescicole extracellulari in soluzione. Agitare le provette dell'ultracentrifuga per 15-20 minuti a temperatura ambiente prima di una miscela finale a vortice.
12. Centrifugare brevemente le provette a una velocità non superiore a 1.000 x g per recuperare la sospensione liquida sul fondo della provetta.
13. Procedere con le fasi di purificazione a gradiente riportate di seguito o, se necessario, conservare la sospensione EV a 4 °C per una notte.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro da 0,45 μm	VWR	Codice 28145-505
Provette per ultracentrifuga da 12 mL	Beckman Coulter	331372
Provette per ultracentrifuga da 5,5 mL	Beckman Coulter	344057
Inibitore della fosfatasi HALT (soluzione 100x)	ThermoFisher Scientifico	Codice: 78420
Inibitore della proteasi HALT (soluzione 100x)	ThermoFisher Scientifico	Codice: 78438
Ibernazione E medio	ThermoFisher Scientifico	A1247601
Rotore a benna oscillante MLS-50	Beckman Coulter	Codice 367280
Ultracentrifuga da banco Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315