Purificazione di sottopopolazioni di vescicole extracellulari: una tecnica per purificare sottopopolazioni di vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità

Abstract

Fonte: Urwitz, S. N. et al. Estrazione di vescicole extracellulari da tessuto intero. J. Vis. (2019)

Questo video dimostra il metodo di purificazione basato sull'ultracentrifugazione a gradiente di densità per isolare sottopopolazioni di vescicole extracellulari adatte per studi di caratterizzazione.

Protocollo

1. Purificazione del gradiente di densità

1. Aggiungere 1,5 mL di iodixanolo al 60% (soluzione madre in acqua) al tampone saccarosio/Tris da 1,5 mL contenente EV per creare una soluzione finale contenente il 30% di iodixanolo. Pipettare su e giù più volte per mescolare accuratamente la soluzione.
   nota: Prestare attenzione per evitare di perdere la soluzione nel puntale della pipetta, poiché l'elevata concentrazione di iodixanolo è piuttosto viscosa.
2. Trasferire la soluzione tampone di iodixanolo al 30% contenente EV sul fondo di una provetta per ultracentrifugazione da 5,5 mL.
3. Preparare almeno 1,5 mL di soluzioni di iodixanolo al 20% e al 10% per campione in acqua ultrapura dalla soluzione madre di iodixanolo al 60%.
4. Misurare 1,3 ml di iodixanolo al 20% e sovrapporlo con cura sopra lo strato di gradiente inferiore utilizzando una siringa e un ago da 18 G. Per evitare di mescolare gli strati all'interfaccia di densità, mantenere lo smusso dell'ago a contatto con l'interno della provetta di ultracentrifugazione appena sopra il menisco e aggiungere la soluzione goccia a goccia.
5. Stendere 1,2 mL di soluzione di iodixanolo al 10% sopra lo strato di iodixanolo al 20% utilizzando la stessa tecnica di cui sopra.
6. Bilanciare e caricare accuratamente le provette per ultracentrifugazione nei cestelli del rotore e centrifugarle in un rotore a secchiello oscillante a 268.000 x g per 50 minuti a 4 °C. Impostare le velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga alle velocità minime consentite per evitare l'interruzione degli strati di densità.
7. Etichettare dieci provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni campione in modo che corrispondano alle frazioni da 1 a 10 dei gradienti di densità. La frazione 1 è designata come la frazione più in alto che verrà rimossa per prima, mentre la frazione 10 è l'ultima frazione rimossa per ultima.
8. Una volta completata l'ultracentrifugazione in gradiente, rimuovere delicatamente le provette dai secchi del rotore e riporle in un supporto stabile. Una banda visibile di vescicole sarà spesso vista nella frazione di interesse. Pipettare dieci frazioni seriali da 490 μl dalla parte superiore del gradiente nelle provette corrispondenti. Sul fondo del tubo rimarrà una piccola quantità di liquido che probabilmente contiene proteine contaminanti. Questo campione può essere scartato o conservato come frazione 11, se lo si desidera.
9. Misurare gli indici di rifrazione delle frazioni utilizzando un rifrattometro. Questa operazione può essere eseguita anche con un gradiente di controllo eseguito in parallelo, se è necessaria la conservazione del campione. Pipettare 20-30 μl di ciascuna frazione contenente iodixanolo sulla superficie del rifrattometro e stimare la densità confrontando gli indici di rifrazione con le densità note di iodixanolo.
   nota: Le frazioni possono essere conservate per una notte nella soluzione contenente iodixanolo, se necessario, prima di procedere alla successiva fase di lavaggio dell'ultracentrifugazione.
10. Trasferire ogni frazione in una provetta per ultracentrifugazione da 12 mL pulita. Aggiungere 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) alla provetta e mescolare pipettando lentamente su e giù.
    NOTA: Il PBS aggiunto ai campioni deve essere privo di particelle, garantito dal filtraggio del PBS sterile attraverso un filtro da 0,22 μm e dalla conservazione a temperatura ambiente per evitare la precipitazione del sale.
11. Aggiungere altri 6 ml di 1x PBS in cima e mescolare di nuovo con cura.
12. Ultracentrifugare le provette a 100.000 x g per 2 ore a 4 °C per ri-pellettare piccole vescicole. Decantare il surnatante e picchiettare le provette a secco prima della lisi delle vescicole per l'analisi delle proteine o della risospensione delle vescicole extracellulari per l'analisi morfologica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro da 0,45 μm	VWR	Codice 28145-505
Provette per ultracentrifuga da 12 mL	Beckman Coulter	331372
Provette per ultracentrifuga da 5,5 mL	Beckman Coulter	344057
Rotore FA-45-6-30	Eppendorf	5820715006
Rotore a benna oscillante MLS-50	Beckman Coulter	Codice 367280
Ultracentrifuga da banco Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315
Ultracentrifuga Optima XE-100	Beckman Coulter	Codice A94516
Optiprep	sigma	D1556	60% di iodixanolo in soluzione acquosa sterile
Refracto 30PX (rifrattometro)	Mettler Toledo	51324650
Rotore S-4-104	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti rotore a benna oscillante	Beckman Coulter	Codice 333790
Centrifuga da tavolo 5804R	Eppendorf	22623508