Generazione di cellule staminali neurali indotte (iNSC) da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC): una procedura basata sul virus Sendai per riprogrammare le PBMNC in iNSC

Abstract

Fonte: Zheng, W. et al. Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleate periferiche e differenziazione verso precursori di neuroni dopaminergici per studi sui trapianti.J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC) in cellule staminali neurali indotte (iNSC) utilizzando il virus Sendai. Il virus Sendai è un virus non integrante che offre un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione delle cellule.

Protocollo

1. Riprogrammazione di PBMNC in iNSC mediante infezione da SeV

1. Preparazione della soluzione e del terreno di coltura
   1. Preparare una soluzione madre di poli-D-lisina (PDL) sciogliendo 100 mg di PDL con 100 mL di H₂O a una concentrazione di 1 mg/mL. Conservare a -20 °C in aliquote da 1 mL.
   2. Preparare una soluzione madre di insulina sciogliendo 100 mg di insulina in 20 mL di HCl 0,01 N a una concentrazione di 5 mg/mL. Conservare a -20 °C in aliquote da 1 mL.
   3. Per preparare 200 mL di terreno basale iNSC, combinare 96 mL di DMEM-F12 e 96 mL di terreno basico (Tabella dei materiali) con 2 mL di soluzione madre di glutammina 100x, 2 mL di aminoacido non essenziale (NEAA), 2 mL di integratore di N2 e 2 mL di integratore di B27. Aggiungere 10 ng/mL di fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante, 3 μM CHIR99021 e 2 μM SB431542 prima dell'uso. Filtrare il substrato e conservarlo a 4 °C.
      nota: Utilizzare il mezzo entro 2 settimane. Aggiungere il fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante, CHIR99021 e SB431542 immediatamente prima dell'uso.
2. Riprogrammazione di PBMNC in iNSC mediante infezione da SeV
   1. Sterilizzare a raggi ultravioletti un banco pulito prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con alcol al 75%. Sterilizzare tutti i puntali utilizzando un'autoclave.
   2. Il giorno 0, raccogliere le cellule in terreno MNC e trasferirle in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 1 mL di terreno MNC preriscaldato.
   3. Conta le cellule vitali con il blu di tripano. Risospendere le cellule con un terreno MNC preriscaldato (37 °C) a una concentrazione di 2 x 10⁵ cellule per pozzetto in piastre a 24 pozzetti.
   4. Dopo aver rimosso i tubi di SeV dallo stoccaggio a -80 °C, scongelare i tubi contenenti SeV in un bagno d'acqua a 37 °C per 5-10 s, quindi lasciarli scongelare a RT. Una volta scongelati, metteteli subito sul ghiaccio.
   5. Aggiungere il SeV che codifica per Klf4, Oct3/4, SOX2 e c-MyC ai pozzetti, con una molteplicità di infezione (MOI) di 10. Centrifugare le celle con piastre a 1.000 x g per 30 minuti per facilitare l'attacco delle cellule. Lasciare le cellule e il surnatante nelle piastre. Porre le piastre nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂,
      ATTENZIONE: Tutte le procedure che coinvolgono SeV devono essere eseguite in un armadio di sicurezza e tutti i puntali e i tubi devono essere trattati con etanolo o candeggina prima dello smaltimento.
   6. Il giorno 1, trasferire il terreno e le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL. Sciacquare il pozzetto con 1 mL di terreno MNC. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 500 μL di terreno MNC fresco preriscaldato in piastre a 24 pozzetti.
      nota: Utilizzare una piastra a 24 pozzetti con attacco basso per evitare l'adesione di celle prima di placcare PDL/laminina.
   7. Il giorno 2, diluire 1 mL di 1 mg/mL di PDL con 19 mL di D-PBS a una concentrazione di 50 μg/mL. Rivestire le piastre a 6 pozzetti con 50 μg/mL di PDL per almeno 2 ore a RT.
   8. Diluire 200 μL di 0,5 mg/mL di laminina con 20 mL di D-PBS a una concentrazione di 5 μg/mL. Aspirare il PDL nelle piastre a 6 pozzetti e asciugare sul banco pulito verticale.
   9. Rivestire le piastre a 6 pozzetti con 5 μg/mL di laminina e incubare per 4-6 ore a 37°C. Lavare con D-PBS prima dell'uso.
   10. Il giorno 3, piastrate le cellule trasdotte ottenute nella fase 1.2.6 in terreno iNSC su piastre a 6 pozzetti rivestite di PDL/laminina.
       nota: Se necessario, spostare delicatamente le piastre dopo che le celle sono state posizionate su piastre rivestite di PDL/laminina, cercando di non disturbare l'attaccamento delle cellule.
   11. Il giorno 5, aggiungere delicatamente 1 mL di terreno iNSC preriscaldato (37 °C) in ciascun pozzetto in piastre a 6 pozzetti.
       nota: Si prevede che le cellule subiranno una morte drastica (>60%).
   12. Il giorno 7, aggiungere delicatamente 1 mL di terreno iNSC preriscaldato (37 °C) in ciascun pozzetto in piastre a 6 pozzetti.
   13. Dal giorno 9 al giorno 28, sostituire ogni giorno il terreno esaurito con un terreno iNSC fresco preriscaldato (37 °C). Monitorare l'emergere di colonie di iNSC. Raccogli e trasferisci i cloni di iNSC per l'espansione in circa 2–3 settimane. Prelevare le colonie con morfologia appropriata utilizzando pipette di vetro bruciate, escludendo eventuali cellule contaminanti, e aspirare le colonie con puntali da 200 μl.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supplemento B27	Invitrogen	17504044
CHIR99021	Operazione genetica	04-0004
DMEM-F12	Gibco	Codice: 11330
DMEM-F12	Gibco	Codice: 11320
Laminina	Roche	11243217001
Integratore N2	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Aminoacido non essenziale
Neurobasale	Gibco	Codice 10888	Base media
Pdl	Sigma-Aldrich	P7280	Poli-D-lisina
SB431542	Operazione genetica	04-0010-10 mg	Conservare dalla luce a -20?
Virus Sendai	Tecnologie per la vita	MAN0009378
insulina	Roche	12585014
Piastra a 24 pozzetti	Corning	Telefono 3337
Tubo conico da 15 ml	Corning	430052
Piastra a 6 pozzetti	Corning	3516
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Eritropoietina umana
Fattore inibitorio della leucemia umana	Millpore	LIF1010
SCF umano ricombinante	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Fattore di crescita insulino-simile umano
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Interleuchina umana 3
desametasone	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM	Gibco	Codice 215056-023	Il medium di Dulbecco modificato di Iscove
insulina	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	Codice 51500-056	Integratore di insulina-transferrina-selenio-X
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × Soluzione madre di glutammina
Prosciutto-F12	Gibco	Codice 11765-054
1-Tioglicerolo	Sigma-Aldrich	Codice: M6145	Tossico per inalazione e contatto con la pelle
acido ascorbico	Sigma-Aldrich	Codice: A92902	Tossico a contatto con la pelle
Sostituzione del siero knockout	Gibco	10828028	Terreno basale libero dal siero
Concentrato lipidico di costituzione chimica definita	Invitrogen	11905031
Transferrina	Sistemi di ricerca e sviluppo	2914-HT-100G
Tripan blu	Gibco	T10282