Isolamento del DNA libero da cellule circolanti (cfDNA): una procedura di membrana a base di silice per estrarre il cfDNA dal plasma sanguigno di pazienti oncologici

Abstract

Fonte: Palande, V. et al. Rilevamento di DNA libero da cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive una procedura di membrana a base di silice per isolare il DNA libero da cellule circolanti o cfDNA da un campione di plasma umano. Il cfDNA è un biomarcatore promettente per la diagnosi e la valutazione del cancro.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Purificazione del cfDNA circolante da 1 mL di plasma

NOTA: Questo passaggio viene eseguito con un kit commerciale (vedere la tabella dei materiali). Tutti i tamponi sono forniti con il kit.

1. Preparazione di tamponi e reagenti
   cautela: Non aggiungere soluzioni acide o candeggina direttamente ai rifiuti di preparazione del campione. I sali di guanidina presenti nel tampone di lisi, nel tampone di legame e nel tampone di lavaggio-1, se combinati con candeggina o acidi, possono produrre composti altamente reattivi.
   1. Tampone legante: Miscelare 300 mL di concentrato tampone legante con 200 mL di isopropanolo al 100% per ottenere 500 mL di tampone legante di lavoro. Conservare a temperatura ambiente.
      nota: Il tampone legante consente il legame ottimale degli acidi nucleici circolanti alla membrana di silice. 500 mL di tampone legante sono sufficienti per il trattamento di 276, 138, 92, 69 o 55 campioni di 1, 2, 3, 4 o 5 mL di plasma rispettivamente ed è stabile per 1 anno a temperatura ambiente.
   2. Wash Buffer-1: Miscelare 19 mL di concentrato Wash Buffer-1 con 25 mL di etanolo al 96-100% per ottenere 44 mL di Wash Buffer-1 di lavoro. Conservare a temperatura ambiente.
      nota: Wash Buffer-1 elimina i contaminanti legati alla membrana di silice. 44 mL di Wash Buffer-1 di lavoro sono sufficienti per il trattamento di 73 campioni di 1/2/3/4/5 mL di plasma ed è stabile per 1 anno a temperatura ambiente.
   3. Wash Buffer-2: Miscelare bene 13 mL di concentrato di Wash Buffer-2 con 30 mL di etanolo al 96-100% per ottenere 43 mL di Wash Buffer-2 di lavoro. Conservare a temperatura ambiente.
      nota: Wash Buffer-2 elimina i contaminanti legati alla membrana di silice. 43 mL di Wash Buffer-2 di lavoro sono sufficienti per l'elaborazione di ~56 campioni di 1/2/3/4/5 mL di plasma ed è stabile per 1 anno a temperatura ambiente.
   4. A una provetta contenente 310 μg di RNA vettore liofilizzato, aggiungere 1.550 μL di tampone di eluizione, per preparare una soluzione di RNA vettore di 0,2 μg/μL. Dopo aver sciolto completamente l'RNA vettore, dividere la soluzione in aliquote adatte e conservarla a una temperatura compresa tra -30 °C e -15 °C. Non congelare-scongelare queste aliquote più di 3 volte. Al tampone di lisi, come mostrato nella Tabella 1, aggiungere l'RNA vettore ricostituito disciolto nel tampone di eluizione.
      nota: Poiché l'RNA vettore non si dissolve direttamente nel tampone di lisi, deve essere disciolto prima in un tampone di eluizione e poi in un tampone di lisi. In primo luogo, il legame tra la membrana di silice e gli acidi nucleici è potenziato quando ci sono pochissime molecole bersaglio presenti nel campione. In secondo luogo, il rischio di degradazione dell'RNA è ridotto a causa della presenza di grandi quantità di RNA vettore.
2. Prima di iniziare l'isolamento, portare le colonne e i campioni a temperatura ambiente e regolare i volumi dei campioni a 1 mL con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), se necessario. Preriscaldare 2 bagnomaria o blocchi riscaldanti che contengono provette da centrifuga da 50 mL e provette da raccolta da 2 mL rispettivamente a 60 °C e 56 °C.
3. A una provetta da centrifuga da 50 mL, aggiungere 100 μL di proteinasi K, 1 mL di plasma e 0,8 mL di tampone di lisi contenente 1,0 μg di RNA vettore (preparato al punto 1.1.4). Chiudere la provetta da centrifuga con un tappo e mescolare il contenuto con un vortice a impulsi per 30 s, garantendo al contempo un vortice visibile nella provetta. Un'accurata miscelazione del contenuto è importante per una lisi efficiente.
   nota: Subito dopo il vortex, procedere al passaggio 1.4, senza indugio.
4. Incubare la soluzione a 60 °C per 30 min.
5. Rimuovere il tappo, aggiungere 1,8 mL di tampone legante alla provetta e miscelare accuratamente con il vortex a impulsi per 15-30 s dopo aver posizionato il tappo.
6. Incubare la miscela risultante per 5 minuti su ghiaccio e inserire la colonna della membrana di silice nell'apparecchio per vuoto collegato alla pompa per vuoto. Quindi, inserire saldamente un estensore della provetta da 20 mL nella colonna aperta per evitare perdite di campione.
7. Versare con cautela la miscela incubata nell'estensore del tubo della colonna e accendere la pompa del vuoto. Dopo che tutta la miscela di lisato scorre completamente attraverso le colonne, spegnere la pompa del vuoto, rilasciare la pressione a 0 mbar e rimuovere e gettare l'estensore del tubo.
   nota: Per evitare la contaminazione incrociata, l'estensore del tubo deve essere smaltito con cura, per evitare che si diffonda sulle colonne adiacenti.
8. Rimuovere la colonna dall'apparecchio per vuoto, inserirla nella provetta di raccolta e centrifugare a 11.000 x g per 30 s a temperatura ambiente, per rimuovere eventuali residui di lisato. Scartare il flusso.
9. Aggiungere 600 μl di Wash Buffer-1 nella colonna, centrifugare a 11.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente, scartare il flusso.
10. Aggiungere 750 μl di Wash Buffer-2 alla colonna, centrifugare a 11.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il flusso.
11. Aggiungere 750 μL di etanolo (96-100%) alla colonna, centrifugare a 11.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il flusso.
12. Centrifugare la colonna a 20.000 x g per 3 minuti, mettendola in una provetta di raccolta pulita da 2 mL.
13. Asciugare completamente il gruppo colonna a membrana inserendolo in una nuova provetta di raccolta da 2 mL con il coperchio aperto e incubando a 56 °C per 10 minuti.
14. Posizionare la colonna in una provetta di eluizione pulita da 1,5 mL. Al centro della membrana della colonna, applicare 20-150 μL di tampone di eluizione e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti con il coperchio chiuso.
    nota: Assicurarsi che il tampone di eluizione sia bilanciato a temperatura ambiente. In caso di utilizzo di tampone di eluizione inferiore a 50 μl, assicurarsi che venga erogato con cura al centro della membrana. Questo aiuta con la completa eluizione del DNA legato. Tuttavia, il volume di eluizione non è fisso e può essere modificato in base alle applicazioni a valle. L'eluato recuperato può arrivare fino a 5 μL e certamente inferiore al volume di eluizione applicato alla colonna.
15. Centrifugare l'eluato recuperato in una microcentrifuga a 20.000 x g per 1 minuto per eluire gli acidi nucleici e conservare a -20 °C.

Numero del campione	Tampone di lisi (mL)	RNA vettore nel tampone di eluizione (μL)
1	0,9	5.6
numero arabo	1.8	11.3
3	2.6	16.9
4	3.5	22,5
5	4.4	28.1
6	5.3	33,8
7	6.2	39,4
8	7	45
9	7.9	50,6
10	8.8	56,3
11	9.7	61,9
12	10.6	67,5
13	11.4	73,1
14	12.3	78,8
15	13.2	84,4
16	14.1	90
17	15	95,6
18	15.8	101,3
19	16.7	106,9
20	17.6	112,5
21	18.5	118,1
22	19.4	123,8
23	20.2	129,4
24	21.1	135

Tabella 1. Volumi del tampone di lisi e dell'RNA vettore (disciolto nel tampone di eluizione) necessari per l'elaborazione di campioni di plasma da 1 mL.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit DNA ad alta sensibilità Agilent	Tecnologie Agilent, Inc.	5067-4626	I saggi DNA ad alta sensibilità sono spesso utilizzati per il controllo della qualità dei campioni per le librerie di sequenziamento di nuova generazione.
provette conservanti cf-DNA/cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Codice 63950	Le provette di conservazione cf-DNA/cf-RNA di Norgen sono provette di plastica chiuse ed evacuate per la raccolta e la conservazione di cfDNA, DNA tumorale circolante, cf-RNA e cellule tumorali circolanti in campioni di sangue intero umano durante la conservazione e la spedizione
Kit di acidi nucleici circolanti QIAamp	Qiagen	Codice: 55114	Il kit per acidi nucleici circolanti QIAamp consente un'efficiente purificazione di questi acidi nucleici circolanti dal plasma o dal siero umano e da altri fluidi corporei privi di cellule.
Collettore per vuoto QIAvac 24 Plus	Qiagen	Anno 19413	Il collettore per vuoto QIAvac 24 Plus è progettato per la lavorazione sottovuoto di colonne QIAGEN in parallelo.
Sistema di connessione QIAvac	Qiagen	Anno 19419	In combinazione con il sistema di connessione QIAvac, il collettore per vuoto QIAvac 24 Plus può essere utilizzato come sistema a flusso continuo. Il flusso del campione, contenente materiale possibilmente infettivo, viene raccolto in un flacone separato.
Sistema di connessione QIAvac	Qiagen	Anno 19419	In combinazione con il sistema di connessione QIAvac, il collettore per vuoto QIAvac 24 Plus può essere utilizzato come sistema a flusso continuo. Il flusso del campione, contenente materiale possibilmente infettivo, viene raccolto in un flacone separato.
misto
Provette da centrifuga da 50 mL
Ghiaccio tritato
Etanolo (96-100%)
Blocco riscaldante o simile a 56 °C (in grado di contenere provette di raccolta da 2 mL)
Isopropanolo (100%)
Microcentrifuga
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
Pipette (regolabili)
Puntali per pipette sterili (si consigliano puntali per pipette con barriere aerosol per aiutare a prevenire la contaminazione incrociata)
Bagnomaria o blocco riscaldante in grado di contenere provette da centrifuga da 50 mL a 60 °C