Analisi automatizzata della distribuzione dimensionale dei frammenti basata sull'elettroforesi capillare del cfDNA: un metodo basato su microchip di DNA per studiare la distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA isolati dai biofluidi

Abstract

Fonte: Palande, V. et al. Rilevamento di DNA libero da cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, analizziamo la distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA libero da cellule o cfDNA utilizzando l'elettroforesi capillare automatizzata. Questa tecnica aiuta a ottenere informazioni sul profilo dei frammenti di DNA rilasciati dalle cellule tumorali durante l'apoptosi.

Protocollo

1. Distribuzione delle dimensioni dei frammenti di DNA del cfDNA da parte dell'analizzatore di frammenti

1. Il passaggio prima di iniziare la procedura: Equilibrare il concentrato di colorante di DNA e la matrice di gel di DNA a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Preparazione della miscela gel-colorante
   nota: Maneggiare le soluzioni con cautela poiché il DMSO è noto per facilitare l'ingresso di molecole organiche nei tessuti.
   1. Scongelare accuratamente il DMSO agitando la fiala di concentrato di colorante di DNA per 10 s. Pipettare 15 μl di questo concentrato in una fiala di matrice di gel di DNA e conservare a 4 °C al buio.
   2. Ancora una volta, agitare la fiala tappata per 10 s fino a quando non viene visualizzata la miscelazione del gel e del colorante.
   3. Versare il composto su un filtro rotante fino al recipiente superiore.
   4. Microcentrifugare il filtro centrifugo a 2.240 x g ± 20% per 10 minuti a temperatura ambiente.
   5. Etichettare il colorante in gel preparato nel tubo e gettare il filtro, secondo le buone pratiche di laboratorio. Etichettare il tubo e annotare la data di preparazione.
      nota: Scartare il filtrato secondo le buone pratiche di laboratorio. La miscela gel-colorante può essere utilizzata per 5 chip di DNA ad alta sensibilità (HS). Se non viene utilizzato per più di 1 ora, conservare a 4 °C. La conservazione al buio è possibile per un massimo di 6 settimane.
3. Per caricare la miscela gel-colorante, assicurarsi della posizione della piastra di base della stazione di adescamento dei trucioli e regolare la clip nella posizione più bassa.
   1. Equilibrare la miscela gel-colorante a temperatura ambiente per 30 minuti, monitorando l'esposizione alla luce.
   2. Prelevare un nuovo chip di DNA HS da un sacchetto sigillato e posizionarlo sulla stazione di adescamento del chip, quindi rimuovere 9,0 μl della miscela gel-colorante ed erogarla sul fondo del pozzetto del chip, contrassegnato come "G".
      nota: Aspirare la miscela gel-colorante, evitando particelle che potrebbero accumularsi sul fondo della fiala. Durante l'erogazione della miscela gel-colorante nel pozzetto del chip HS DNA, inserire completamente la punta della pipetta per evitare la formazione di grandi bolle d'aria. Inoltre, toccare la pipetta ai bordi del pozzetto produrrà scarsi risultati.
   3. Posizionare lo stantuffo a 1 mL e chiudere la stazione di adescamento dei trucioli. Assicurarsi che il blocco del fermo scatti e impostare il timer su 60 s, quindi premere lo stantuffo verso il basso finché non viene trattenuto dalla clip e, esattamente dopo 60 s, rilasciare lo stantuffo con il meccanismo di rilascio della clip.
   4. Quando lo stantuffo si ritira almeno fino al segno di 0,3 mL, attendere 5 s, quindi tornare lentamente alla posizione di 1 mL, quindi aprire la stazione di adescamento del chip e rimuovere nuovamente 9,0 μl della miscela gel-colorante ed erogare sul fondo del pozzetto del chip HS DNA, contrassegnato come "G".
4. Per caricare il marcatore del DNA, erogare 5 μl del marcatore del DNA nel pozzetto, contrassegnato dal simbolo della scala. Ripetere la procedura per tutti gli 11 pozzetti di campionamento.
5. Per caricare la scala e i campioni, erogare 1 μL della scala del DNA nel pozzetto, contrassegnato dal simbolo della scala, quindi aggiungere 1 μL di campione (pozzetti usati) o 1 μL di marcatore (pozzetti non utilizzati) in tutti gli 11 pozzetti del campione.
6. Agitare il chip HS DNA per 60 s a 2.400 giri/min posizionando il chip orizzontalmente nell'adattatore. Assicurarsi che il rigonfiamento che fissa il chip di DNA HS non venga danneggiato durante il vortex.
7. Per inserire il chip HS DNA nello strumento analizzatore di frammenti, aprire il coperchio e assicurarsi che la cartuccia dell'elettrodo sia inserita correttamente e che il selettore del chip sia posizionato su "dsHigh Sensitivity DNA" nello strumento analizzatore di frammenti.
8. Montare con cautela il chip HS DNA nella presa, che si inserisce in un solo modo, quindi chiudere il coperchio assicurandosi che la cartuccia dell'elettrodo si inserisca esattamente nei pozzetti del chip HS DNA.
9. Il display sullo schermo del software dell'analizzatore di frammenti indica il chip di DNA HS inserito e il coperchio chiuso attraverso l'icona del chip in alto a sinistra dello schermo.
10. Per avviare l'esecuzione del chip HS DNA, selezionare il test ad alta sensibilità dsDNA dal menu "Analisi" sullo schermo dello strumento, quindi compilare correttamente la tabella dei nomi dei campioni inserendo informazioni come nomi e commenti dei campioni e avviare l'esecuzione del chip facendo clic sul pulsante "Start" in alto a destra dello schermo.
11. Pulizia dell'elettrodo dopo l'esecuzione di un chip HS DNA: rimuovere immediatamente il chip HS DNA usato non appena il test è completato e smaltirlo secondo le buone pratiche di laboratorio. Eseguire la seguente procedura per assicurarsi che gli elettrodi siano puliti, senza residui residui del test precedente.
    1. Riempire lentamente 350 μl di acqua deionizzata per l'analisi in uno dei pozzetti del pulitore degli elettrodi e posizionare il pulitore degli elettrodi nello strumento analizzatore di frammenti aprendo il coperchio, quindi chiudere il coperchio e attendere circa 10 s.
    2. Rimuovere il pulitore per elettrodi aprendo il coperchio e attendere altri 10 secondi affinché l'acqua sugli elettrodi evapori prima di chiudere il coperchio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumento bioanalizzatore 2100	Tecnologie Agilent, Inc.	G2939BA	Il sistema 2100 Bioanalyzer è un affermato strumento automatizzato di elettroforesi per il controllo della qualità dei campioni di biomolecole.
Clip regolabile per stazione di adescamento	Tecnologie Agilent, Inc.	Codice: 5042-1398	Utilizzato in combinazione con la siringa per applicare una pressione definita per l'adescamento del truciolo.
provette conservanti cf-DNA/cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Codice 63950	Le provette di conservazione cf-DNA/cf-RNA di Norgen sono provette di plastica chiuse ed evacuate per la raccolta e la conservazione di cf-DNA, DNA tumorale circolante, cf-RNA e cellule tumorali circolanti in campioni di sangue intero umano durante la conservazione e la spedizione
Stazione di adescamento trucioli	Tecnologie Agilent, Inc.	Codice 5065-4401	Utilizzato per caricare la matrice di gel in un chip con una siringa fornita con ciascun kit di analisi, utilizzato per saggi di RNA, DNA e proteine. Include stazione di adescamento, cronometro e 1 clip per siringa
Kit di pulizia degli elettrodi	Tecnologie Agilent, Inc.	Codice: 5065-9951	Previene la contaminazione incrociata. Rimuove i contaminanti batterici o proteici dagli elettrodi.
Filtri per Gel Matrix	Tecnologie Agilent, Inc.	Codice 185-5990	Utilizzato per una corretta miscelazione del concentrato di colorante DNA e della matrice di gel di DNA
Vortice di chip di base IKA	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Utilizzato per la corretta miscelazione della scala di DNA e del campione di DNA sui chip di saggio del bioanalizzatore
Provette da centrifuga da 50 ml
Etanolo (96-100%)
Blocco riscaldante o similare a 56 °C (in grado di contenere provette di raccolta da 2 ml)
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
Pipette (regolabili)
Puntali per pipette sterili (si consigliano puntali per pipette con barriere aerosol per aiutare a prevenire la contaminazione incrociata)
Bagnomaria o blocco riscaldante in grado di contenere provette da centrifuga da 50 mL a 60 °C