Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline: un metodo per generare reazioni di PCR con nanogocce per rilevare rare mutazioni tumorali

Abstract

Fonte: Bonner, E. R. et al. Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, presentiamo una procedura passo-passo per generare nano-goccioline emulsionate per rilevare gli acidi nucleici bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi digitale o dPCR.

Protocollo

1. Rilevamento e quantificazione del DNA bersaglio utilizzando la dPCR

1. Preparare la miscela di reazione dPCR per 8 pozzetti della provetta per strisce PCR più il 10% in più, aggiungendo 220 μl di master mix di genotipizzazione, 8,8 μl di sonde wildtype e mutanti da 10 μM, 39,6 μl di primer diretti e inversi da 10 μM e 17,6 μl di olio stabilizzante per goccioline.
2. Miscelare delicatamente la miscela di reazione dPCR pipettando l'intero volume su e giù 10-20 volte. Non agitare o centrifugare dopo che l'olio stabilizzante delle goccioline è stato aggiunto alla miscela di reazione.
3. Procurarsi una provetta per PCR a 8 pozzetti ed erogare 38 μL di miscela di reazione dPCR direttamente sul fondo di ciascun pozzetto. Rimuovere eventuali bolle con un puntale per pipetta pulito.
   NOTA: Le provette a strisce per PCR che sono interbloccate o impacchettate strettamente insieme possono provocare cariche elettriche statiche, causando coalescenza e segnale rumoroso durante l'analisi dei dati dPCR. Per evitare ciò, aliquotare i tubi in sacchetti separati per il rischio biologico, evitare di imballare eccessivamente i sacchetti ed evitare che i tubi si sfreghino tra loro.
4. Aggiungere 12 μl di campione di DNA preamplificato nei pozzetti appropriati della provetta per PCR. Per il controllo negativo, aggiungere 12 μl di MB H₂O.
   NOTA: Analizzare i campioni di cfDNA nei pozzetti replicati. Per il liquido cerebrospinale, analizzare almeno in duplicato e per plasma/siero analizzare ogni campione in triplicato.
5. Pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte per mescolare la miscela di reazione con il campione di DNA.
6. Procurarsi un nuovo chip per lo strumento generatore di goccioline e pipettare l'intero volume dai pozzetti 1-8 della provetta per PCR nei corrispondenti canali A-H del chip. Evitare di toccare la parte inferiore dei canali con la punta di una pipetta.
7. Procurarsi una nuova provetta per PCR pulita e inserirla nello strumento che genera goccioline. Eseguire la scansione o inserire manualmente l'ID del chip dello strumento che genera le goccioline nel software del computer dello strumento. Immettere i nomi per ciascuno degli 8 canali. Fare clic su Avvia l'esecuzione per iniziare a eliminare i campioni.
8. Al termine della gocciolizzazione, rimuovere la provetta per PCR e applicare i tappi delle provette per strip.
9. Trasferire la provetta a strisce in un termociclatore e bilanciarla con un'altra provetta a strisce contenente 80 μl di acqua per pozzetto.
10. Programmare le condizioni dei cicli termici come: 95 °C per 10 minuti; 45 cicli di due temperature: 95 °C per 30 s e temperatura di ricottura per 2 minuti; 98 °C per 10 minuti; e mantenere a 10 °C.
    1. Impostare la velocità di rampa su 0,5 °C/s e impostare il volume del campione su 80 μL.
11. Al termine del ciclo termico, rimuovere il tubo di strippaggio e trasferirlo allo strumento di quantificazione. Rimuovere i cappucci delle strisce PCR e sostituirli con tappi ad alta velocità.
12. Accendere lo strumento di quantificazione e il computer collegato con il software dello strumento. Avviare il software dello strumento e fare clic su Configura una corsa.
13. Posizionare la provetta nello strumento di quantificazione.
14. Ottenere un nuovo chip per lo strumento di quantificazione e scansionare o inserire manualmente l'ID del chip nello strumento. Inserire il chip nella macchina.
15. Posizionare la protezione metallica sulla parte superiore del chip e chiudere il coperchio dello strumento.
16. Nel software del computer, inserire un nome per l'esecuzione della dPCR e per ciascuno degli 8 canali (A–H). Selezionare la modalità Veloce (che deve essere utilizzata con i condensatori ad alta velocità) e fare clic su Avvia per iniziare la quantificazione.
17. Al termine della quantificazione, rimuovere lo schermo metallico (da salvare e riutilizzare) e smaltire la provetta e il chip della striscia PCR. Sul computer dello strumento, il registro di esecuzione conterrà i file dei risultati per ogni esecuzione. Utilizzare i file con estensione fcs per ogni campione per l'analisi con il software di analisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di consumabili Raindance	Bio-Rad	Codice 20-04411	Contiene chip per strumenti che generano goccioline, chip per strumenti di quantificazione, cappucci per strisce PCR, inclusi tappi ad alta velocità, e olio stabilizzatore per goccioline
Strumento Raindance Sense	Bio-Rad		Strumento di quantificazione
Strumento sorgente Raindance	Bio-Rad		Strumento generatore di goccioline
Software RainDrop Analyst II	Tecnologie RainDance		Software analista utilizzato per l'analisi dei dati
Termomiscelatore C	Eppendorf	14 285 562PM
MiniAmp Termociclatore	Thermofisher Scientifico	Codice: A37834
Tappi per provette con striscia a 8 pozzetti PCR	VWR	Codice 10011-786
Provette per PCR a 8 pozzetti	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Hot Start ad alta fedeltà 2x Master Mix	Nuova Inghilterra Biolabs Inc	Codice: M0494S