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1. Coltura cellulare e preparazione dello scaffold
NOTA: Gli scaffold devono essere preparati 48 ore prima dell'impianto nei topi. I seguenti volumi sono forniti in base allo scaffolding. Moltiplicare le quantità necessarie per scaffold aggiuntivi.
- Tagliare gli scaffold in poli(acido lattico) (PLA) in pezzi delle dimensioni di una cavità di resezione (circa 2 mm x 2 mm). I ponteggi possono essere tagliati a mano usando le forbici o usando un perforatore per la ripetibilità.
- Sterilizzare immergendo in etanolo al 70% per 15 minuti seguito da immersione in PBS. Posizionare l'impalcatura nel terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina mentre si preparano le cellule per la semina.
- Sollevare le MSC coltivate utilizzando tripsina allo 0,05% (3-5 ml per un matraccio T75). Incubare a 37 °C per 5 min. Assicurarsi che le cellule si siano sollevate, quindi aggiungere 7-10 ml di DMEM al pallone per inattivare la tripsina.
- Trasferire il contenuto del pallone in una provetta da centrifuga da 15 mL. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Pellet 5 x 105 MSC per ogni ponteggio tramite centrifugazione a 100 x g per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le MSC in 5 μL di DMEM per 5 x 105 cellule.
- Preparare le impalcature per la semina asciugandole.
- Rimuovere un'impalcatura dall'immersione in DMEM con una pinza e posizionarla temporaneamente sul coperchio della piastra a 6 pozzetti. Solleva l'impalcatura dal coperchio, lasciando dietro di sé una goccia di DMEM in eccesso.
- Riposizionare l'impalcatura sul coperchio in un luogo nuovo e asciutto. Ripeti 3-5 volte, quindi posiziona l'impalcatura parzialmente essiccata in una nuova piastra a 6 pozzetti per la semina. Ripetere l'operazione per ogni impalcatura.
nota: Un'impalcatura parzialmente essiccata fornisce risultati ottimali di semina cellulare. Se l'impalcatura è troppo bagnata, le celle scivoleranno via dall'impalcatura e aderiranno alla piastra del pozzetto sottostante. Se l'impalcatura è troppo secca, la gocciolina non si diffonderà sull'intera impalcatura, con conseguente scarsa distribuzione iniziale delle cellule.
- Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente la fiala di cellule staminali per omogeneizzare la sospensione poiché alcune cellule potrebbero essersi depositate sul fondo.
- Pipettare lentamente 2,5 μl di sospensione di MSC appena miscelata direttamente sullo scaffold, creando una piccola gocciolina sopra lo scaffold.
- Aggiungere 300 μl di DMEM ai bordi di ciascun pozzetto. Ciò impedirà la rapida evaporazione della gocciolina cellulare. Incubare a 37 °C per 30 minuti, lasciando che le cellule si attacchino all'impalcatura.
- Con una pinza, capovolgere delicatamente le impalcature nella piastra a pozzetti. Seminare 2,5 μl di sospensione di MSC appena miscelata (questo si traduce in un totale di 5 x 105 cellule seminate per scaffold ). Incubare a 37 °C per 30 minuti, lasciando che le cellule si attacchino all'impalcatura.
- Coprire gli scaffold in DMEM aggiungendo 2 mL a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Sollevare delicatamente le impalcature per consentire ai fluidi di fluire sotto di esse. Incubare a 37 °C in questo stato per 48 ore prima dell'intervento di impianto.
- Controllare gli scaffold dopo 24 ore e aggiungere/sostituire il terreno se si osserva un'evaporazione eccessiva o uno scolorimento del terreno dovuto a uno squilibrio del pH.