Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Resezione guidata da fluorescenza e impianto di scaffold
NOTA: Sterilizza tutti gli strumenti prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Posizionare la cornice stereotassica sul tavolino di uno stereomicroscopio da dissezione a fluorescenza.
- Anestetizzare il topo sotto isoflurano inalato in una camera di induzione. Una volta anestetizzato, fissare il topo nel telaio stereotassico con l'alimentazione continua di anestesia inalatoria tramite un adattatore per cono nasale in isoflurano. Mantenere la temperatura corporea con un termoforo e/o una sonda.
NOTA: L'isoflurano al 4-5% è adatto per l'induzione e il 2-3% è adatto al mantenimento, ma questo deve essere adattato e monitorato per ogni topo.
- Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza della cornea. Sterilizzare il sito di incisione del cuoio capelluto con una serie di tre salviette alcoliche e tre betadine.
- Eseguire il test del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi su ciascun arto e confermare la risposta negativa per garantire una corretta anestesia. Garantire una frequenza respiratoria costante a circa 55-65 respiri/min.
- Usando una pinza, pizzicare e sollevare delicatamente il cuoio capelluto. Praticare un'incisione rostrale-caudale lineare sulla linea mediana con le forbici chirurgiche. Irrigare il sito dell'incisione con PBS e rimuovere il grasso sottocutaneo con un applicatore con punta di cotone con un movimento circolare di spazzolatura. Disporre la pelle in modo che la finestra cranica precedentemente stabilita sia completamente visibile.
- Forare delicatamente la dura madre all'interno dei bordi della finestra cranica usando un ago da 18G. Ripetere fino a quando l'incisione non traccia completamente l'interno della finestra.
- Rimuovere la dura madre staccandola con una pinza fine, rivelando il parenchima e il tumore sottostanti.
- Localizzare il tumore U87 mCh-Fl spegnendo le luci della stanza e attivando la modalità di fluorescenza dello stereomicroscopio. Prepararsi per la resezione caricando un puntale per pipetta da 1-200 μl all'estremità del tubo di una pompa per vuoto.
- Accendere la pompa del vuoto. Resecare il tumore aspirando delicatamente il tessuto fluorescente fino a quando non rimane alcun segnale. Spegnere la pompa del vuoto ed eliminare il puntale della pipetta. Spegni la fluorescenza e riaccendi le luci della stanza.
NOTA: Per controllare il sanguinamento, irrigare con PBS freddo e applicare una pressione costante con un applicatore con punta di cotone. Nei casi più gravi, la cavità di resezione può anche essere temporaneamente riempita con un agente emostatico, purché venga rimossa dopo che l'emorragia si è fermata, seguita da un'altra irrigazione PBS.
- Immediatamente prima dell'impianto, immergere lentamente un'impalcatura in PLA seminata con MSC in PBS per rimuovere i terreni indesiderati e i componenti associati. Impiantare l'impalcatura nella cavità di resezione. Se necessario, aggiungere 1 μL di fibrinogeno (67-106 mg/mL) seguito da 1 μL di trombina (400-625 U/mL) per fissare l'impalcatura in posizione.
- Con la dura madre rimossa e il lembo osseo dalla finestra cranica già scartato, sigillare la ferita semplicemente chiudendo la pelle e applicando la colla chirurgica. Togliere l'animale dall'anestetico inalato e lasciarlo recuperare su una superficie riscaldata.
