Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Marcatura delle cellule di glioblastoma con il costrutto FP635 o FP720
- Produrre e purificare il lentivirus secondo il protocollo descritto di seguito:
- Osserva i piatti seminati il giorno 1. Quando le cellule sono confluenti all'80-90%, sono pronte per la trasfezione.
NOTA: Le cellule dovrebbero avere ancora spazio per subire 1-2 divisioni cellulari
- Preparare la miscela plasmidica aliquotando i quattro plasmidi in una provetta da 50 mL. Per la preparazione di un piatto da 12 × 15 cm, utilizzare 270 μg di vettore di trasferimento, 176 μg di pMDL (Gag/Pol), 95 μg di pVSVG (glicoproteina del virus della stomatite vescicolare) e 68 μg di pREV.
- Preparare 13,5 mL di 0,25M CaCl2 (diluire con ddH2O filtrato) e aggiungere alla miscela plasmidica. Aggiungere 13,5 mL di soluzione BBS 2×. Mescolare delicatamente capovolgendo più volte e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (22–26°).
- Aggiungere la miscela di trasfezione (distribuendola in gocce) su ciascuna piastra (2,25 mL per piastra). Agitare delicatamente le piastre e incubare al 3% di CO2, 37 °C per una notte (16-20 ore).
- Osserva le cellule. Dovrebbero raggiungere la confluenza. Se un marcatore visibile (come la GFP) è presente nel plasmide lentivettore, l'efficienza di trasfezione può essere valutata visivamente. Idealmente, l'efficienza di trasfezione dovrebbe essere del >90%.
- Rimuovere il terreno, aggiungere 15 mL di DMEM fresco + 2% FBS a ciascuna piastra e trasferire al 10% di CO2, 37 °C. Incubare per una notte.
- Raccogliere il primo raccolto di surnatante: Raccogliere e raggruppare il surnatante (12 piastre × 15 ml/piastra = 180 ml) dalle ciotole.
- Aggiungi 15 ml di DMEM fresco + 2% FBS a ogni piatto. Incubare le piastre al 10% di CO2, 37 °C per una notte. Il recipiente contenente il surnatante lentivirale deve essere messo in un contenitore secondario (un sacchetto di plastica sigillato andrà bene) e conservato a 4 °C.
- Concentrare il preparato virale: Concentrare le particelle virali mediante ultracentrifugazione. Centrifugare il surnatante a 70.000 x g per 2 ore a 20 °C. Si consigliano tubi conici (al contrario dei tubi a fondo tondo) e rotori a secchiello oscillante (al contrario dei rotori ad angolo fisso) (semplicemente perché questa combinazione rende il pellet quasi invisibile più facile da localizzare). Utilizziamo provette coniche con rotore Beckman SW28 (capacità per sei provette) a 19.400 giri/min per 2 ore a 20 °C. Riempire le provette con 30 mL di surnatante. Il volume totale del surnatante da una preparazione di piatti da 12 × 15 cm è di 360 ml; Pertanto, l'elaborazione dell'intero volume richiederà due giri consecutivi. Caricare i tubi, eseguire il primo giro, versare il surnatante senza disturbare il pellet, ricaricare con surnatante virale fresco ed eseguire il secondo giro.
- Versare il surnatante e lasciare scolare il liquido rimanente appoggiando i tubi capovolti su carta assorbente. Aspirare le goccioline rimanenti utilizzando un aspiratore per rimuovere tutto il liquido dal pellet. Il pellet dovrebbe essere appena visibile come una piccola macchia traslucida.
- Risospendere i pellet virali in 100 μl di 1× HBSS. Evita di schiumare. Sciacquare le provette con 100 μl di 1× HBSS. Raggruppare entrambi i volumi per ottenere un volume finale di 200 μl.
- Trasferire in una provetta per microfuge con tappo a vite, avvolgere in parafilm e agitare a bassa velocità per 15-30 minuti. Il preparato virale risospeso apparirà ovunque, da limpido a leggermente lattiginoso.
- Eliminare la sospensione centrifugando per 10 s su una microcentrifuga da tavolo. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microfuge con tappo a vite. Preparare aliquote da 20 μl del surnatante. Questo surnatante virale è di qualità in vitro.
- Coltura di circa 2,0 x 106 cellule da una linea cellulare di glioma umano con DMEM più il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un piatto di 15 cm; oppure coltura di 2,0 x 106 sfere di glioblastoma umano derivate da pazienti (GBM-PDX) con DMEM/F12 1:1 con integratore di B27 più fattore di crescita epidermico ricombinante umano (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) in un pallone T75.
- Mantenere tutte le celle a 37 °C, 5% di CO2 e 100% di umidità relativa.
- Dissociare le cellule.
- Per le cellule di glioma: rimuovere il surnatante dalle piastre e aggiungere 3-5 mL di tripsina 1X alle cellule di glioma.
- Per le sfere di GBM: raccogliere le cellule pipettandole in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare le sfere di GBM a 200 x g per 5 minuti utilizzando una centrifuga da tavolo a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 3-5 mL di soluzione per il distacco cellulare.
- Incubare tutte le cellule a 37 °C per 10-15 minuti.
- Dissociare attentamente le cellule pipettando su e giù più volte (assicurarsi che le sfere e le cellule di glioma siano completamente dissociate) e ruotare verso il basso a 200 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 5 mL di terreno pipettando più volte verso l'alto e verso il basso. Determinare la vitalità cellulare mediante esclusione del blu di tripano.
- Piastra 1,0 x 106 di cellule bersaglio in una piastra da 10 cm con 5 mL di terreno mediante pipettaggio.
- Trasdurre le cellule con lentivirus che esprimono proteine fluorescenti alla molteplicità di infezione (MOI) 5 e incubarle a 37 °C.
- Dopo 24 ore, rimuovere il terreno dalle cellule trasdotte, aggiungere 5 mL di terreno fresco e incubare per altre 48 ore a 37 °C.
- Dissociare le cellule infette in una sospensione unicellulare utilizzando la tripsina come descritto sopra. Far girare le cellule a 200 x g per 5 minuti e risospendere in 500 μl di soluzione di selezione (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con FBS all'1%).
- Pipettare la sospensione cellulare in provette FACS. Colorare le cellule con 1 μL/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) dicloridrato per escludere le cellule morte. Sono necessari controlli negativi per impostare i cancelli del citometro a flusso (cellule non trasdotte e cellule non trasdotte/colorate DAPI).
- Smistare le cellule fluorescenti positive/DAPI-negative in una soluzione di smistamento e raccogliere le cellule selezionate in una provetta conica da 15 mL.
- Centrifugare le cellule selezionate a 200 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in 5 mL di terreno di coltura. Seminare le cellule selezionate in una piastra di 10 cm mediante pipettaggio. Incubare a 37 °C per almeno 48-72 h.
- Espandere le cellule ordinate dissociando le cellule come descritto sopra e piastrelle in più piastre per esperimenti in vivo.