Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1.Imaging FMT
NOTA: Secondo l'obiettivo sperimentale, le cellule di glioblastoma marcate con iRFP possono essere monitorate in vivo prima, durante o dopo il trattamento. A scopo di imaging, anestetizzare gli animali utilizzando una camera di induzione dell'isoflurano, mantenerli in una cassetta di imaging durante la scansione e creare l'immagine nella docking station dell'imager FMT.
- Togliere l'animale dalla gabbia e metterlo nella camera di induzione dell'isoflurano. Chiudere la camera e accendere il flusso di ossigeno e il vaporizzatore al 3–5%.
- Monitorare l'animale fino a quando non è completamente anestetizzato, di solito entro 1-2 minuti. Gli animali incoscienti non dovrebbero rispondere agli stimoli esterni.
- Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera e inserire l'animale nella cassetta di imaging posizionando prima l'adattatore per la testa, quindi posizionando l'animale a faccia in giù. Assicurarsi che la testina si trovi al centro della cassetta.
- Posizionare la piastra superiore della cassetta sulla parte superiore e serrare le manopole di regolazione fino a 17 mm.
- Una volta che l'animale è al sicuro nella cassetta di imaging, procedere all'imaging inserendo la cassetta nella docking station interna dell'imager FMT, dove l'isoflurano viene pompato per mantenere l'animale anestetizzato.
- Eseguire il software dell'imager e dell'analizzatore facendo doppio clic sull'icona del software.
- Nella finestra "Scheda sperimentale", selezionare "Database" e "Gruppo di studio".
- Vai alla finestra "Scheda Scansione" e seleziona il soggetto da fotografare facendo clic su "seleziona soggetto". Inoltre, selezionare il canale laser nel pannello "Canale laser". Per le celle marcate FP635, selezionare "canale laser 635 nm" e per le celle marcate FP720, selezionare "canale laser 680 nm".
- Acquisisci un'immagine facendo clic sull'opzione "Acquisisci" nella finestra "Scheda Scansione". Quindi, regolare il campo di scansione facendo clic e trascinando il campo di scansione nell'immagine acquisita su un determinato numero di posizioni di origine, in genere entro 20-25 sorgenti per il lato omolaterale.
- Seleziona l'opzione "Aggiungi alla coda di ricostruzione" e premi "Scansione" nella finestra "Scheda Scansione".
- Attendere il completamento della scansione, quindi rimuovere la cassetta di imaging dalla docking station.
- Rimuovere la piastra superiore della cassetta e riposizionare l'animale nella gabbia.
- Ripetere i passaggi 1.1-1.12 per il resto degli animali.
2. Analisi delle immagini
- Dal software dell'imager e dell'analizzatore, selezionare la finestra "Scheda Analisi".
- Caricare il dataset e l'oggetto da analizzare cliccando sul pulsante "+" nel pannello "Selezione dataset" della finestra "Scheda Analisi".
- Una volta caricata l'immagine nella finestra "Scheda Analisi", eseguire l'analisi della regione di interesse (ROI) selezionando l'icona ellissoide, situata nell'angolo in alto a sinistra della finestra "Scheda Analisi".
- Regola la soglia a zero nel pannello "dati statistici" facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna "soglia" nella finestra "Scheda Analisi".
- Il valore totale nel pannello "Dati statistici" rappresenta il segnale proveniente dalle cellule di glioblastoma marcate con fluorescenza impiantate nel cervello del topo.
- Ripetere i passaggi 2.2-2.4 per il resto degli animali. Carica o rimuovi un nuovo oggetto facendo clic sul pulsante "+" o "-", rispettivamente, nel pannello "Selezione set di dati" della finestra "Scheda Analisi".