Saggio di migrazione delle cellule staminali del tumore cerebrale (BTSC) per studi di trattamento farmacologico: una tecnica di imaging in vitro di cellule vive per analizzare l'effetto del trattamento farmacologico sulla migrazione delle BTSC

Abstract

Fonte: Restall, I. et al. Saggi di imaging di cellule vive per studiare il glioblastoma, il tumore cerebrale, la migrazione e l'invasione delle cellule staminali. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, eseguiamo un test di migrazione delle cellule staminali del tumore cerebrale per analizzare l'effetto del farmaco di interesse sulla migrazione delle cellule staminali del tumore cerebrale vivo utilizzando la piastra di migrazione della chemiotassi. L'imaging su cellule vive facilita la visualizzazione e la quantificazione della migrazione cellulare durante il saggio.

Protocollo

1. Saggio di migrazione delle cellule staminali del tumore cerebrale

1. Seminare 200.000 cellule in un pallone T25 in 8 mL di terreno completo 1-2 settimane prima di pianificare l'esecuzione di un saggio di migrazione.
   nota: Il tempo che intercorre tra la piastratura e l'esecuzione del test varia a seconda del tasso di crescita della coltura BTSC utilizzata.
   1. Per testare l'effetto di un trattamento farmacologico sulla migrazione, pretrattare le cellule con il veicolo appropriato, come il DMSO, e il farmaco di interesse aggiungendo volumi applicabili del veicolo o dello stock di farmaco direttamente in pozzetti separati di terreno contenenti le cellule.
2. Preparare la placca di migrazione della chemiotassi (Figura 1A) ricoprendola con un sottile strato di collagene.
   1. Calcola il numero di pozzetti di una piastra per chemiotassi a 96 pozzetti che dovrà essere rivestita con collagene. Includi almeno tre pozzetti di replica per ogni condizione.
   2. Diluire 5 mg/mL di stock di collagene di tipo I a 0,2 mg/mL in acido acetico puro diluito allo 0,14% in acqua di coltura.
   3. Pipettare 0,2 mg/mL di collagene sia nei pozzetti dell'inserto della membrana che nei pozzetti del serbatoio inferiore utilizzati.
      nota: I serbatoi inferiori della piastra richiedono 225 μl e i pozzetti dell'inserto della membrana richiedono 75 μl di collagene per un rivestimento adeguato.
   4. Posizionare la piastra di migrazione in un incubatore a 37 °C per 1 ora. Aspirare la soluzione di collagene dai pozzetti senza graffiare il rivestimento di collagene.
   5. Lavare i pozzetti 2 volte con 1 PBS sterile. Se la piastra non viene utilizzata immediatamente, aspirare il PBS e conservarlo a 4 °C per un massimo di 2 settimane. Prima dell'uso, riscaldare la placca di migrazione della chemiotassi a temperatura ambiente.
3. Preparare il serbatoio inferiore della placca di migrazione della chemiotassi.
   1. Pipettare 225 μl di terreno (senza fattori di crescita), addizionato con il 10% di FBS come chemioattrattivo, nei pozzetti del serbatoio inferiore della placca di migrazione della chemiotassi.
   2. Posizionare delicatamente l'inserto della membrana nel serbatoio inferiore ad angolo per evitare la creazione di bolle.
4. Placcare le cellule nell'inserto della membrana della placca di migrazione della chemiotassi.
   1. Risospendere le BTSC dissociate in terreni (senza fattori di crescita) a una densità cellulare di 50.000 cellule/mL. Aggiungere farmaci ai media se si valuta la migrazione durante diversi trattamenti farmacologici. In alternativa, seminare un numero uguale di cellule pretrattate e cellule di controllo, mantenendo la concentrazione finale del farmaco durante la piastratura.
   2. Piastra 50 μl di BTSC dalla fase 1.4.1 in ciascun pozzetto della piastra di migrazione nelle condizioni di trattamento desiderate.
5. Immagina la migrazione della chemiotassi.
   1. Posizionare la piastra di migrazione della chemiotassi nel sistema di imaging delle cellule vive e impostare il software di imaging automatizzato per acquisire immagini microscopiche della piastra ogni 1-2 ore per un massimo di 72 ore. Utilizzando un software commerciale (vedere la Tabella dei materiali), fare clic con il pulsante destro del mouse sulla timeline e impostare l'intervallo di scansione su ogni 2 ore per 24 ore
      nota: L'intervallo di tempo e il tempo totale trascorso variano tra le impostazioni cultura BTSC utilizzate; iniziare con intervalli di 2 ore per 72 ore fino a quando non si è acquisita esperienza con le singole colture BTSC. Se non è disponibile un sistema di imaging automatizzato, le immagini dello stesso campo visivo possono essere acquisite manualmente con un microscopio e una fotocamera collegati al software di imaging.
   2. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, ottenere le immagini per l'intero esperimento e creare una definizione di elaborazione utilizzando il software di analisi che differenzia le cellule dallo sfondo della membrana e dai pori di migrazione (Figura 1B, maschera rossa). Utilizzando un software commerciale (vedere la Tabella dei materiali), selezionare una nuova definizione di lavorazione e impostare le impostazioni di definizione di lavorazione per le BTSC su una soglia di seed di 52, una soglia di crescita di 85, regolazioni delle dimensioni (pixel) di -1 e un'area minima di 200 μm². Applicare questa definizione di lavorazione al lato inferiore della membrana. Modificare questa analisi se non distingue accuratamente le cellule dalla membrana di fondo.
   3. Raccogli i dati come l'area della superficie cellulare sul lato inferiore della membrana per ciascuno dei tre pozzetti replicati, che conta solo le cellule che sono migrate attraverso i pori. Rappresentare graficamente la migrazione delle cellule in μm² (area delle cellule migrate) nel tempo (Figura 1C).
      nota: Assicurarsi che il numero relativo di cellule piastrate e contate sulla superficie superiore della membrana al primo punto temporale sia simile (meno del 20% di variazione in tutti i pozzetti) tra tutte le condizioni di trattamento per evitare qualsiasi effetto di una placcatura irregolare. La raccolta dei dati tramite il software commerciale (vedi Tabella dei materiali) può essere eseguita avviando la definizione di lavorazione creata nel passaggio 1.5.2, cliccando su Metriche, quindi su Grafico/esporta e infine su Esportazione dati.

Risultati

Figura 1: Imaging su cellule vive di una migrazione di BTSC. (A) Questo è un esempio di una piastra di migrazione per chemiotassi a 96 pozzetti rivestita con un sottile strato di collagene di tipo I prima di eseguire il saggio di migrazione con BTSC. Le immagini mostrano i) una piastra con tutte e tre le parti (coperchio, inserto a membrana e serbatoio) posizionate i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Matrice di Matrigel	Corning	Codice 356230
piastre a 96 pozzetti	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Provetta conica Falcon 15 mL	ThermoFisher	352096
Piastra per chemiotassi a 96 pozzetti ClearView per incuciti	Essen Bioscience	4582
Sistema di analisi delle cellule vive IncuCyte Zoom	Essen Bioscience	4545
Software di analisi delle cellule vive IncuCyte Zoom	Essen Bioscience	2016A Rev1
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	sigma	D8537
Acqua di grado di coltura	Lonza BioWhittaker	17-724Q
Siero fetale bovino (FBS)	Invitrogen	Codice 12483-020
Collagene di ratto I	Trevigen	Codice 3440-100-01
Soluzione di distacco cellulare Accumax	Tecnologie cellulari innovative	AM105