1. Saggio di invasione della neurosfera delle cellule staminali del tumore cerebrale
- Seminare 200.000 cellule in 8 mL di terreno completo in un pallone T25 1-2 settimane prima di pianificare l'esecuzione di un saggio di invasione.
nota: Il tempo che intercorre tra la piastratura e l'esecuzione del test dipenderà dal tasso di proliferazione della coltura BTSC utilizzata.
- Per le cellule pretrattate, aggiungere il composto di interesse al pallone alla concentrazione desiderata per il corso temporale predeterminato prima che le neurosfere siano pronte per essere piastrate per l'invasione.
- Attendere fino a quando la dimensione media della neurosfera è di circa 150-200 μm; in genere, questo richiede 7-14 giorni, a seconda della coltura BTSC utilizzata.
nota: È tipico osservare una distribuzione delle dimensioni delle sfere nel pallone.
- Puntare e mescolare delicatamente il pallone con una pipetta e spostare 500 μL di neurosfere BTSC in una provetta conica da 1,5 mL per ogni condizione di trattamento; questa verrà utilizzata per piastrare tre pozzetti replicati.
NOTA: i passaggi da 1.3.1 a 1.3.2 sono facoltativi ma consigliati per il primo esperimento di invasione su una nuova cultura BTSC.
- Per determinare la densità delle neurosfere che finiranno nel pozzetto, preparare una provetta da 1,5 mL come al punto 1.3. Mescolare delicatamente le neurosfere e spostare 100 μl in una piastra separata da 96 pozzetti e lasciare che le neurosfere si stabilizzino per gravità per 5 minuti.
- Controllare il numero di neurosfere al microscopio per assicurarsi che più neurosfere siano nella regione del pozzo che verrà ripreso senza sovraffollarlo.
nota: Le neurosfere invasive richiedono spazio sufficiente per triplicare il diametro senza interagire con le neurosfere vicine. Il numero di neurosfere per pozzetto può essere regolato contando il numero di neurosfere per pozzetto e aggiungendo più o meno neurosfere dal pallone T25 alla provetta conica da 1,5 mL nel passaggio 1.3.
- Posizionare la provetta conica da 1,5 mL con le cellule del passaggio 1.3 sul ghiaccio ed eseguire i passaggi 1,5-1,7 sul ghiaccio.
- Lasciare che le neurosfere si depositino per gravità sul fondo della provetta conica da 1,5 ml per 5 minuti e preraffreddare una piastra a 96 pozzetti etichettata su ghiaccio.
- Risospendere le neurosfere nella proteina della matrice extracellulare.
- Preparare 500 μL di una soluzione di collagene di tipo I da 0,4 mg/mL su ghiaccio per ogni condizione di trattamento: aggiungere 459 μL di terreno (senza fattori di crescita), 40 μL della soluzione madre di collagene da 5 mg/mL e 0,92 μL di NaOH sterile 1N (Tabella 1).
NOTA: Sono necessari 500 μL di soluzione di collagene per condizione di trattamento: 100 μL per ciascuno dei tre pozzetti replicati e 200 μL di eccesso. I trattamenti farmacologici devono essere aggiunti qui alla concentrazione finale desiderata, sottratta dal componente medio della soluzione. Questo protocollo descrive l'uso del collagene di tipo I come proteina della matrice extracellulare; Tuttavia, qualsiasi proteina della matrice extracellulare può essere testata. Inoltre, per le colture BTSC che hanno tassi di invasione più lenti, i fattori di crescita o FBS possono essere integrati nei media per aumentare il tasso di invasione.
- Dopo che le neurosfere dal passaggio 1.5 si sono stabilizzate, aspirare la maggior parte del terreno senza perdere la pallina di neurosfera che si è depositata sul fondo. Risospendere delicatamente le neurosfere in 500 μL della soluzione di collagene preparata al punto 1.6.1.
- Aggiungere 100 μl della miscela di collagene e neurosfera a tre pozzetti replicati della piastra a 96 pozzetti su ghiaccio. Lasciare che le neurosfere si depositino sul ghiaccio per 5 minuti.
- Trasferire la piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per consentire la polimerizzazione del collagene.
- Prepararsi immediatamente a creare un'immagine della piastra a 96 pozzetti.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel vassoio di un sistema di imaging di cellule vive o sul tavolino di un microscopio per acquisire un'immagine come riferimento per le dimensioni della neurosfera al momento della piastra, prima dell'inizio dell'invasione.
- Acquisire immagini ogni ora fino a quando il tasso di invasione non si è stabilizzato; in genere, ciò avviene entro 24 ore
nota: L'intervallo di imaging può essere modificato a seconda dell'apparecchiatura utilizzata. L'intervallo di imaging e il tempo totale trascorso possono essere modificati anche per le colture BTSC che hanno diversi tassi di invasione.
- Determinare l'aumento della superficie delle BTSC man mano che invadono la matrice nel tempo.
nota: L'area superficiale delle cellule al momento della piastratura, calcolata come la media di tre pozzetti replicati, deve essere simile (meno del 20% di variazione tra tutti i pozzetti) tra le diverse condizioni di trattamento per garantire che le differenze nell'invasione di BTSC non siano fortemente influenzate dal numero o dalle dimensioni delle neurosfere piastre.
- Per il sistema di analisi delle cellule vive, utilizzare un obiettivo 10X per l'acquisizione delle immagini e acquisire quattro immagini per pozzetto per i tre pozzetti replicati. Per determinare l'area relativa della superficie cellulare, rappresentata come la percentuale di confluenza del pozzetto, impostare una definizione di elaborazione che evidenzi in modo specifico le celle sullo sfondo del pozzetto. Utilizzando un software commerciale (vedere la Tabella dei materiali), selezionare una nuova definizione di lavorazione e impostare la regolazione della segmentazione su 0,8, l'area minima su 300 μm2 e l'eccentricità massima su 0,99. Modificare questa analisi se non distingue accuratamente le celle dallo sfondo.
nota: Se si utilizzano altri metodi per visualizzare l'invasione della neurosfera nel tempo, si consiglia di ottenere più campi visivi per i tre pozzetti replicati nel tempo. Tuttavia, non visualizzare lo stesso identico campo visivo ad ogni intervallo aumenterà l'errore standard dei dati raccolti. Il software del computer può essere utilizzato per aiutare a misurare la superficie delle cellule invasive in ogni immagine.
- Raccogli i dati come area totale della superficie cellulare (relativa o assoluta) per ogni pozzetto in ogni punto temporale e determina la media dei tre pozzetti replicati. Rappresenta graficamente l'invasione delle BTSC tracciando l'aumento dell'area cellulare nel tempo.
| Preparazione della soluzione di collagene |
| Stock [Collagene] (mg/mL) | 5 |
| Finale [Collagene] (mg/mL) | 0,4 |
| Numero di pozzi necessari: | 5 |
| Volume totale (μL) | 500 |
| Volume di collagene madre (μL) | 40 |
| Volume di 1N NaOH (μL) | 0,92 |
| Volume del terreno (μL) | 459 |
Tabella 1: Preparazione della soluzione di collagene di tipo I 0,4 mg/mL. Sono elencate le concentrazioni iniziali e finali desiderate della soluzione di collagene di tipo I. I volumi elencati sono sufficienti per placcare le neurosfere in tre pozzetti replicati, più due per l'eccesso, e possono includere una singola condizione di trattamento, come descritto in dettaglio nella fase 1 del protocollo.
