Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle diapositive modellate
- Preparazione del substrato per la micropatterning
- Trattare i vetrini coprioggetti circolari da 18 mm mediante attivazione aria/plasma per 5 minuti. Porre i vetrini coprioggetti in una camera chiusa con 100 μl di (3-amminopropil) trietossisilano in un essiccatore per 1 ora.
- Incubare con 100 mg/mL di poli (glicole etilenico)-succinimidil valerato (peso molecolare 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM di tampone carbonato, pH > 8, per 1 ora. Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura e asciugare sotto una cappa chimica.
nota: In questa fase, il campione può essere conservato a 4°C al buio per un ulteriore utilizzo.
- Aggiungere il fotoiniziatore, 4-benzoilbenzoiltrimetilammonio cloruro (PLPP), a 14,7 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
nota: Può essere utilizzata anche una forma concentrata di PLPP, un gel PLPP. Ne risulta un tempo di illuminazione ultravioletta (UV) più breve necessario per degradare la spazzola PEG (100 mJ/mm2).
- Deposizione di gel fotoiniziatore
- Preparare una miscela di 3 μl di gel PLPP e 50 μl di etanolo assoluto da depositare al centro del vetrino. Porre il campione sotto una cappa chimica fino alla completa evaporazione dell'etanolo assoluto.
nota: In questa fase, il campione può essere conservato a 4°C al buio per un ulteriore utilizzo.
- Micropatterning di vetrini
- Monta il vetrino coprioggetti in una camera Ludin e posizionalo sul tavolino motorizzato di un microscopio dotato di un sistema di messa a fuoco automatica.
- Caricare le immagini corrispondenti ai micropattern previsti nel software. Applicare questi parametri: replicazione 4 x 4 volte, spaziatura di 200μm, dose UV di 1.000 mJ/mm2. Dopo la sequenza di illuminazione UV automatica, risciacquare il PLPP con più lavaggi PBS.
nota: Se è stato utilizzato il gel PLPP, rimuoverlo con lavaggi estesi con acqua deionizzata, asciugare in un flusso di N2 e conservare a 4 °C.
- Incubare con laminina (50 μg/mL in PBS) per 30 min. Lavare abbondantemente con PBS.
NOTA: Una soluzione fluorescente di proteina fluorescente verde purificata (GFP, 10 μg/mL in PBS) può essere miscelata con laminina per visualizzare i micropattern mediante microscopia a fluorescenza.
2. Preparazione di neuroni e cellule GBM per la co-coltura
- Coltura dei neuroni ippocampali embrionali di ratto
- Sezionare l'ippocampo di ratti embrionali (E18) e trasferire il tessuto in una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)/1 mM di 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico acido (HEPES)/penicillina-streptomicina in una provetta da 15 mL. Rimuovere la soluzione in eccesso senza asciugare l'ippocampo.
- Aggiungere 5 mL di tripsina-etilendiammina tetraacetica (EDTA) integrata con penicillina (10.000 unità/mL)/streptomicina (10.000 μg/mL) e 1 mM di HEPES e incubare per 15 minuti a 37 °C. Lavare 2 volte con la soluzione HBSS/HEPES/penicillina-streptomicina e lasciare che il tessuto rimanga in questa soluzione per 2-3 minuti.
- Dissociare il fazzoletto utilizzando due pipette Pasteur lucidate a fiamma, pipettando su e giù 10 volte con ciascun fazzoletto, facendo attenzione a ridurre al minimo la formazione di schiuma. Contare le cellule e valutare la vitalità della sospensione cellulare. Placcare i neuroni su vetrini coprioggetti micromodellati come indicato di seguito.
nota: Il tasso di vitalità cellulare è dell'85-90% dopo l'estrazione.
- Coltura cellulare per neuroni su vetrini coprioggetti micromodellati
- Reidratare i vetrini micromodellati con PBS e incubare il terreno di coltura cellulare neuronale completo.
- Seminare i neuroni ippocampali ottenuti da ratti E18 Sprague-Dawley direttamente sul vetrino coprioggetti micromodellato a una densità di 50.000 cellule per cm2 in terreno neurobasale (NBM) arricchito con il 3% di siero di cavallo. Posizionare i neuroni microstrutturati nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 48 h.
nota: Dopo ~6 ore, si possono vedere i neuroni primari dell'ippocampo aderire ai micropattern di laminina.
- Co-coltura di cellule staminali simili al GBM umano su neuroni
- Man mano che le cellule a forma di sferoide crescono in sospensione, centrifugare la sospensione per 5 minuti a 200 × g. Lavare gli sferoidi con 5 mL di PBS e incubare le cellule con 0,5 mL di reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) per 5 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 4,5 ml di NBM completo (integrato con integratore di B27, eparina, fattore di crescita dei fibroblasti 2, penicillina e streptomicina, come descritto in precedenza) e contare le cellule utilizzando una tecnica di conteggio automatico.
- Semina 1.000 cellule GBM sulla coltura neuronale micropatternata in NBM arricchita con il 3% di siero di cavallo. Incubare la piastra a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.
