Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Semina e Coltura dei Capillari Bovini
- Giorno 0: Mescolare 0,7 mL di stock di collagene IV con 6,3 mL di PBS. Aggiungere la soluzione in un matraccio T75 e lasciare il matraccio per 2 ore a temperatura ambiente (RT) o lasciarlo per una notte a 4 °C.
- Rimuovere la soluzione di collagene dal pallone e lavare tre volte con PBS.
- Aggiungere 7 mL di soluzione di lavoro di fibronectina e lasciare il pallone per 30 minuti a RT. Quindi, rimuovere la soluzione di fibronectina e seminare i capillari subito dopo.
- Durante il tempo di attesa di 30 minuti, scongelare una fiala di capillari in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Quando i capillari sono scongelati, trasferire immediatamente in una provetta da centrifugazione con 30 mL di DMEM-comp e centrifugare per 5 minuti a 500 x g e RT. Rimuovere DMEM-comp dalla provetta e risospendere il pellet capillare in 10 mL di DMEM-comp fresco.
- Trasferire la sospensione da 10 mL nel pallone T75 rivestito e lasciare che i capillari aderiscano al fondo del pallone per 4-6 ore in un'incubatrice a 37 °C al 10% di CO2,
nota: Il tasso di crescita cellulare è più alto al 10% di CO2 piuttosto che al convenzionale 5% di CO2.
- Dopo 4-6 ore di incubazione, ispezionare il matraccio al microscopio ottico. Le frazioni di capillari dovrebbero ora essere attaccate al fondo del pallone (Figura 1, giorno 0).
- Preparare GM e aspirare il terreno DMEN-comp con molta attenzione dai capillari e sostituirlo con 10 ml di GM appena fatto.
- Giorno 2: Rimuovere il GM dai capillari e sostituirlo con 10 ml di GM appena prodotto. A questo punto, la crescita cellulare dai capillari dovrebbe essere visibile al microscopio ottico (Figura 1, giorno 2-3).
2. Isolamento dei periciti primari dai capillari cerebrali bovini
- Giorno 4: Ispezionare i capillari al microscopio ottico.
nota: Il pallone dovrebbe ora essere confluente per circa il 60-70% per fornire una quantità appropriata di periciti (Figura 1, giorno 4). In caso contrario, sostituire il GM con 10 mL di terreno fresco e lasciare il pallone nell'incubatore per un altro giorno.
- Aspirare il terreno e lavare delicatamente le cellule in PBS.
- Aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA scongelata per le cellule endoteliali e lasciare il pallone nell'incubatore per 1-3 minuti. Estrarre frequentemente il pallone e osservare con il microscopio durante questo periodo di tempo.
nota: Le cellule endoteliali devono arrotondarsi e staccarsi dal pallone; I periciti dovrebbero essere visibili come cellule con una morfologia "fantasma" ed essere ancora attaccati alla superficie del pallone. Questo è un passaggio delicato e importante.È essenziale rimuovere la maggior parte delle cellule endoteliali per evitare la contaminazione della monocoltura dei periciti, ma anche una tripsinizzazione prolungata può staccare i periciti. Il tempo di tripsinizzazione può variare leggermente di volta in volta, ed è quindi della massima importanza osservare frequentemente il matraccio con il microscopio durante il trattamento.
- Picchiettare delicatamente il pallone, quando le cellule endoteliali hanno iniziato ad arrotondarsi, per staccare le cellule endoteliali allentate.
- Per fermare la tripsinizzazione, aggiungere 10 mL di DMEM-comp al pallone. Sciacquare accuratamente il matraccio alcune volte con il terreno per rimuovere le cellule endoteliali. Aspirare la sospensione di cellule endoteliali dal pallone. Le cellule endoteliali possono ora essere utilizzate per altri scopi.
- Aggiungere 10 ml di DMEM-comp al pallone. Guarda sotto il microscopio ottico per assicurarti che i periciti siano ancora presenti e attaccati al fondo. Rimettere il pallone nell'incubatrice per consentire la crescita della coltura arricchita di periciti.
nota: È importante osservare la cultura durante i giorni successivi. Se c'è ancora un discreto numero di cellule endoteliali in crescita, può essere eseguito un altro trattamento con tripsina.
- Consentire alla monocoltura dei periciti di crescere con il cambio del terreno DMEM-comp. ogni due giorni. Controllare la crescita delle cellule al microscopio ottico (Figura 1, giorno 5-8).
