Isolamento dei capillari cerebrali dal cervello umano: un metodo ottimizzato per estrarre i capillari cerebrali dal tessuto cerebrale umano

Abstract

Fonte: Hartz, A. M. S. et al. Isolamento dei capillari cerebrali dal tessuto cerebrale umano fresco. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video presenta l'isolamento dei capillari cerebrali da un tessuto cerebrale umano fresco. I capillari isolati possono quindi essere utilizzati per generare un modello di barriera ematoencefalica ex vivo.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione del Campione di Cervello

NOTA: La Figura 1A mostra il grafico del flusso di lavoro dell'intera procedura di isolamento descritta di seguito. Il tessuto cerebrale umano può provenire da qualsiasi parte della corteccia e può essere utilizzato fresco o congelato. Il tessuto cerebrale congelato può essere scongelato a temperatura ambiente (senza tampone; ~30 min per 10 g). Per ottenere risultati comparabili, il tessuto cerebrale dovrebbe essere ottenuto dalla stessa regione cerebrale per ogni esperimento. Questo protocollo è ottimizzato per la corteccia cerebrale umana fresca (intervallo post-mortem o PMI <4 ore) che non è stata congelata.

1. Preparazione del tessuto cerebrale umano: Documentare il peso del tessuto cerebrale. Tutti i numeri nel seguente protocollo sono appropriati per 10 g di tessuto cerebrale umano fresco. Posizionare il tessuto cerebrale in una capsula di Petri da 100 mm. Rimuovere con cura tutte le meningi con una pinza. Usa un bisturi per tagliare la sostanza bianca.
2. Tritare il tessuto cerebrale umano: Tagliare con cura il tessuto cerebrale e tritarlo con un bisturi. Tritare per circa 5 minuti (pezzi da 2-3 mm). Trasferire il tessuto cerebrale nel tritatessuti Potter-Elvehjem. Aggiungere 30 mL di tampone di isolamento.
   nota: I pezzi di tessuto tritato sono difficili da vedere poiché il tessuto cerebrale si trasforma in poltiglia attraverso il processo di tritatura.

2. Omogeneizzazione

1. Macinatore di tessuti Potter-Elvehjem (distanza: 150-230 μm): omogeneizzare ogni campione con 100 colpi a una velocità dell'omogeneizzatore di 50 giri/min. Documentare il tempo ogni 25 bracciate e il tempo totale necessario per 100 bracciate. Vedere la Tabella 1 per un protocollo di omogeneizzazione proposto; Il tempo totale per omogeneizzare 10 g di corteccia frontale umana è di circa 22 minuti. Non mescolare l'aria per evitare bolle.
2. Omogeneizzatore Dounce (distanza: 80–130 μm): trasferire l'omogeneizzato in un omogeneizzatore Dounce su ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione con 20 colpi (~6 s/corsa, totale di ~2 min). Evita le bolle.

3. Centrifugazione

1. Distribuire equamente l'omogeneizzato cerebrale in quattro provette da centrifugazione da 50 ml e documentare il volume totale dell'omogeneizzato. Distribuire 50 mL di tampone a gradiente di densità nelle provette da centrifugazione (12,5 mL per provetta). Utilizzare 10 ml di tampone isolante per sciacquare il pestello e l'omogeneizzatore e distribuirli nelle quattro provette da centrifugazione (~2,5 ml per provetta).
2. Chiudere ermeticamente le provette da centrifuga con i tappi. Mescolare l'omogeneizzato, il mezzo di gradiente di densità e il tampone agitando energicamente le provette. Centrifuga a 5.800 x g per 15 min a 4 °C (rotore ad angolo fisso); Selezionare una velocità di decelerazione media per mantenere il pellet attaccato al tubo. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet in 2 mL di BSA all'1%.

4. Filtrazione

NOTA: Per separare i capillari dai globuli rossi e da altri detriti cellulari, sono necessari diversi passaggi di filtrazione.

1. Maglia da 300 μm: Dopo aver risospeso il pellet, filtrare la sospensione attraverso la rete da 300 μm. I capillari vengono filtrati attraverso la rete, mentre i vasi più grandi e i detriti cerebrali più grandi rimangono sulla rete. Lavare accuratamente la rete con un massimo di 50 ml di BSA all'1%. Eliminare la mesh.
   nota: Questa fase di filtrazione elimina la sospensione capillare da eventuali vasi più grandi o pezzi di detriti cerebrali.
2. Filtro per deformazioni cellulari da 30 μM
   nota: Questa fase di filtrazione separa i capillari dai globuli rossi e da altri detriti cerebrali.
   1. Distribuire il filtrato capillare dal passaggio 4.1 sui cinque filtri per deformazione cellulare da 30 μm (circa 10 mL di filtrato capillare per filtro per deformazione cellulare). I capillari sono trattenuti da questo filtro, mentre i globuli rossi, altre singole cellule e piccoli detriti cerebrali passano attraverso il filtro e vengono raccolti nel filtrato.
   2. Lavare ogni filtro con 25 mL di 1% BSA. Successivamente, versare tutti i filtrati sul sesto filtro per aumentare la resa. Lavare ogni filtro con 50 mL di BSA all'1%; Mantenere i filtri di deformazione cellulare con i capillari e scartare il filtrato.

5. Raccolta capillare

1. Capovolgere i filtri e lavare i capillari con 50 mL di BSA all'1% per ciascun filtro in provette da 50 mL. Applicare delicatamente una pressione con la punta della pipetta di un pipettatore da 5 ml e spostarla sul filtro per lavare via i capillari cerebrali.
2. Assicurati di lavare via tutti i capillari cerebrali, in particolare dal bordo del filtro. Evitare le bolle poiché ciò rende più difficile il processo di filtrazione e aumenta la possibilità di perdita capillare.

6. Lavaggio

1. Dopo aver raccolto i capillari, centrifugare tutti i campioni a 1.500 x g per 3 minuti a 4 °C (rotore a secchiello oscillante). Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in circa 3 mL di tampone di isolamento. Combinare tutti i pellet risospesi da un campione in una provetta conica da 15 mL e riempirla con un tampone di isolamento. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 3 minuti a 4 °C e lavare altre due volte.
2. Documentare la purezza dei capillari con un microscopio (ingrandimento 100X) e una fotocamera (Figura 1B).
   nota: La resa capillare cerebrale da 10 g di tessuto cerebrale umano è solitamente di circa 100 mg. I capillari cerebrali isolati possono ora essere utilizzati per esperimenti, elaborati (ad es. lisato, isolamento della membrana) o congelati e conservati a -80 °C in criotubi per un minimo di 6-12 mesi (evitare più cicli di congelamento-scongelamento).

Tratti	Ore
1-25	7-7,5
26-50	5-5,5
51-75	5-5,5
76-100	5-5,5
Tempo totale:	22-24 minuti

Tabella 1: Protocollo di omogeneizzazione. Il protocollo di omogeneizzazione per il macinatore di tessuti Potter-Elvehjem per omogeneizzare 10 g di corteccia frontale umana a una velocità di omogeneizzazione di 50 giri/min. Si noti che i primi tratti richiedono più tempo per omogeneizzare il tessuto tritato. Dopo questa omogeneizzazione iniziale, ogni corsa ha una durata di 12 s (6 s per il movimento verso il basso, 6 s per il movimento verso l'alto). Pertanto, dopo l'omogeneizzazione iniziale, è possibile eseguire 5 corse in 1 minuto o 25 corse in 5 minuti.

Results

Figura 1: Diagramma di flusso per l'isolamento capillare. (A) Il pittogramma illustra le fasi principali della procedura per isolare i capillari cerebrali dal tessuto umano fresco. (B) L'immagine mostra i capillari cerebrali umani isolati al microscopio ottico subito dopo l'isolamento (ingrandimento 100X).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)
Guanti in lattice Diamond Grip Plus, Microflex Medium	VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti	Codice 32916-636	Ppe
Camici protettivi monouso	VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti	Codice 470146-214	DPI; a causa della natura del materiale di origine umana, si consiglia l'uso di un camice da laboratorio monouso
Visiera, monouso	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	19460102	DPI; a causa della natura del materiale di origine umana, si raccomanda l'uso di una visiera monouso
Materiali di sicurezza
Clavies Sacchetti per Autoclave ad Alta Temperatura 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	01-815-6
Carta da banco a secco Versi 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	14-206-32	Per coprire le aree di lavoro
Sistemi di contenitori VWR Sharps	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	75800-272	Per bisturi usati
Candeggina 8,2% Clorox germicida 64 oz.	Centro di approvvigionamento del Regno Unito, Lexington, KY, Stati Uniti	323775
Attrezzatura
4 °C Frigorifero	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	Codice 13-986-148
Misuratore di pH Accume BASIC AB15	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	AB15
Controllo Heidolph RZR 2102	Heidolph, Elk Grove Village, IL, Stati Uniti	501-21024-01-3
Centrifuga Sorvall LEGEND XTR	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	75004521
Microscopio da dissezione Leica L2	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL, Stati Uniti		Usato per rimuovere le meningi
Omogeneizzatore POLYTRON PT2500	Kinematica AG, Lucerna, Svizzera	9158168
Scala P-403	Denver Instrument, Boemia, NY, Stati Uniti	191392
Mini Stir standard	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	1151050
Thermo-Flask Azoto Liquido Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, Stati Uniti	11-670-4C	Utilizzato per congelare il tessuto
Bilancia analitica Voyager Pro	OHAUS, Parsippany, NJ, Stati Uniti	VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, Stati Uniti		Utilizzato per controllare i capillari isolati
Strumenti e vetreria
Finnpipette II Pipetta 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	Codice 21377823T1	Lavare i capillari dal filtro
Finnpipette II Pipetta 100-1.000 μL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	Codice 21377821T1	Risospensione del pellet in BSA
Ragazzo Pipet	Integra, Hudson, NH, Stati Uniti	739658
Provette Falcon da 50 mL 25/rack - 500/cs	VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti	Codice 21008-951
Lame per bisturi EISCO	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	S95938C	Per tritare il tessuto cerebrale
PARAFILM	VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti	Codice: 52858-000	Per coprire becher e matraccio tarato
Thermo Scientific Punte per pipette Finntip 5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	21-377-304	Per lavare i capillari dal filtro
Siringa da 60 ml con Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stati Uniti	BD309653	Utilizzato con anello di collegamento per filtrare i capillari
Manico per bisturi #4	Strumenti di scienza fine, Foster City, CA, Stati Uniti	Codice 10060-13	Utilizzato per tritare
Pinze Dumont #5	Strumenti di scienza fine, Foster City, CA, Stati Uniti	Codice 11251-10	Usato per rimuovere le meningi
Potter-Elvehjem Smerigliatrice per tessuti	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, Stati Uniti	3.43E+28	Volume 50 mL, distanza: 150-230 μm
Omogeneizzatore a balze	VWR, Radnor PA Stati Uniti	62400-642	Volume 15 mL, clearance: 80-130 μm
Filtri in tessuto Spectra/Mesh (300 μm)	Laboratori Spectrum, Rancho Dominguez, CA, Stati Uniti	146424	Utilizzato per filtrare la sospensione capillare per rimuovere eventuali meningi che possono essere rimaste
pluriFiltri (dimensione dei pori: 30 μm)	pluriSelect Life Science, Lipsia, Germania	Numero 43-50030-03
Anello connettore	pluriSelect Life Science, Lipsia, Germania	41-50000-03	Riutilizza più volte
Pallone tarato da 1 litro			Per la preparazione del buffer di isolamento
1 L di bicchiere			Per la preparazione di 1% BSA
Barra di agitazione			Per la preparazione di 1% BSA e Ficoll®
Bottiglia Schott (60 mL)			Per la preparazione del Ficoll®
Secchiello per il ghiaccio			Per mantenere tutto freddo
Piastra Petri da 100 mm			Per la macinazione del tessuto cerebrale
Raschietto cellulare per colture tissutali	VWR, Radnor, Pennsylvania, Stati Uniti	Codice 89260-222	Per rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione
Prodotti chimici
BSA Frazione V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	A9647-500g	Preparare in DPBS con Ca2+ e Mg2+ il giorno prima. Evitare le bolle durante la preparazione. Conservare in frigorifero. Mescolare lentamente per 10 minuti prima dell'uso.
DPBS con Ca2+ e Mg2+	Clone	SH30264.FS	DPBS - parte del buffer di isolamento
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	F4375	La misurazione esatta è importante qui. Pesare in bottiglia con ancoretta di combustione. Agitare viguramente dopo aver aggiunto DPBS. Conservare in frigo O/N. Sarà sereno al mattino. Mescolare delicatamente per 10-15 minuti prima dell'uso. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
Glucosio (D-(+) Destrosio)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	G7528	Concentrazione di glucosio (D-(+) destrosio): 5 mM
Soluzione standard di idrossido di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	Codice: 71474	Per regolare il pH del DPBS
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	P2256	Concentrazione: 1 mM