Zimografia peptidica fluorescente: una tecnica modificata per rilevare l'attività della proteasi utilizzando substrati fluorogenici in gel per zimogrammi

Abstract

Fonte: Deshmukh, A. A. et al. Rilevamento dell'attività della proteasi mediante zimografia peptidica fluorescente. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, eseguiamo la zimografia, una tecnica elettroforetica, per analizzare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici.

Protocollo

1. Elettroforesi di campioni biologici in gel per zimografia peptidica

1. Sciogliere i campioni in tampone per campioni per zimografia convenzionale (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glicerolo, 4% SDS, 0,01% blu di bromofenolo). Per i campioni di cellule e tessuti, si raccomandano ~30 μg di proteine totali per pozzetto e 50-100 ng di proteine per gli standard MMP.
2. Aggiungere 400 ml di 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer all'apparecchio in gel. Caricare fino a 35 μL di campione per pozzetto. Far scorrere i campioni a 120 V a 4 °C per 1,5 ore o fino a quando gli standard di peso molecolare indicano che le proteasi di interesse si trovano all'interno dello strato di gel che risolve i peptidi (che ha un colore arancione visibile).
   nota: La maggior parte delle MMP e le loro varianti rientrano nell'intervallo 35-100 kDa. Quando gli standard di peso molecolare indicano che tali pesi si trovano all'interno dello strato di gel che risolve i peptidi, l'elettroforesi può essere interrotta. Lo stesso principio può essere applicato ad altre classi di proteasi con pesi molecolari noti. Se c'è un interesse nel rilevare più proteasi su una gamma più ampia di pesi molecolari, ridurre le dimensioni dello strato di gel che si risolve e aumentare le dimensioni dello strato di gel che risolve il peptide.
3. Dopo l'elettroforesi, rimuovere i gel dalla cassetta di plastica e lavare i gel tre volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente agitando delicatamente in tampone rinaturante contenente il 2,5% di Triton X-100, 1 μM di ZnCl₂ e 5 mM di CaCl₂ in 50 mM di Tris-HCl, pH 7,5.
4. Trasferire i gel in una soluzione tampone di sviluppo contenente l'1% di Triton X-100, 1 μM di ZnCl₂ e 5 mM di CaCl₂ in 50 mM di Tris-HCl, pH 7,5 per 15 minuti. Sostituire con una soluzione tampone di sviluppo fresca e incubare i gel a 37 °C in leggera agitazione per 24 ore, assicurandosi che i gel siano completamente immersi nella soluzione.
5. Dopo 24 ore, l'immagine viene gelificata utilizzando uno scanner/imager su gel fluorescente utilizzando gli appropriati filtri di eccitazione ed emissione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cassette gel vuote da 1,5 mm	ThermoFisher Scientifico	NC2015
Soluzione SDS al 20%	Ambion	AM9820
3x tampone per campioni di zimografia	Bio-Rad	1610764
Kit Azido-PEG3-Maleimmide	Fare clic su Strumenti di chimica	AZ107
Alimentatore di base PowerPac	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	Codice 161-0374
Aghi ipodermici PrecisionGlide	Fisher Scientifico	14-826