Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Sistema a ultrasuoni focalizzato
NOTA: La configurazione descritta è un sistema di disgregazione BBB costruito internamente basato su componenti disponibili in commercio e include un cono personalizzato stampato in 3D e una piattaforma stereotassica staccabile. Il sistema è progettato in modo modulare, il che facilita le modifiche in base alle attrezzature disponibili e all'uso specifico. Il protocollo descrive la procedura per la sonoporazione di un'area più ampia nella regione pontina del cervello del topo. Regolando la posizione del bersaglio, è stato possibile prendere di mira diverse parti del cervello. In questo studio è stato utilizzato un trasduttore monoelemento da 1 MHz con una lunghezza focale di 75 mm, un'apertura di 60 mm e un'area focale di 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM di pressione di picco). Il piano focale del trasduttore è posizionato attraverso il cranio dell'animale sul piano orizzontale che si interseca con le barre auricolari.
- Selezionare un trasduttore appropriato per l'apertura della BBB nei roditori.
nota: In base alle proprietà delle microbolle e alla frequenza impiegata, le impostazioni acustiche, in particolare l'indice meccanico (MI), sono soggette a modifiche.
- Posizionare il trasduttore nel cono stampato in 3D.
- Utilizzare una membrana in mylar acusticamente trasparente all'estremità inferiore del cono per ottenere l'accoppiamento acustico del percorso di propagazione del fascio e riempire il cono con acqua degassata.
- Montare il trasduttore sopra l'animale su un tavolino lineare motorizzato come mostrato nella Figura 1 consentendo il posizionamento verticale automatico del trasduttore.
- Progettare una piattaforma stereotassica staccabile in base ai requisiti dello studio, che include riscaldamento a temperatura regolata, barre per morsi e orecchie, anestesia e marcatori fiduciali multimodali, come mostrato nella Figura 1 e nella Figura 2. Il montaggio della piattaforma stereotassica è costituito da un sistema di tavolino lineare 2D, che consente un posizionamento automatico preciso (< 0,1 mm) dell'animale sotto la trave.
- Collegare il trasduttore alla catena di emissione acustica mostrata in Figura 1 , composta da un trasduttore, un generatore di funzioni e un amplificatore di potenza.
- Ideare una pipeline di elaborazione delle immagini per rilevare i marcatori fiduciali multimodali che consentono un targeting preciso della sonoporazione dell'area cerebrale di interesse e la raccolta dei dati di cavitazione rilevati dall'idrofono dell'ago.
- Calibrare il sistema e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore in corrispondenza del posizionamento verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica.
2. Preparazione degli animali
NOTA: Il seguente protocollo è specificato per i topi, ma può essere adattato per i ratti. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi femmina atimica nudi Foxn1-/- (6-8 settimane).
- Lasciare che l'animale si acclimati per almeno una settimana nella struttura per animali e pesare regolarmente l'animale.
- Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea (s.c.) 30 minuti prima del trattamento FUS per iniziare il trattamento analgesico.
- Anestetizzare l'animale con isoflurano al 3%, 2 L/min O2 e verificare che l'animale sia profondamente anestetizzato. Mantieni gli animali anestetizzati durante l'intera procedura e monitora la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca per regolare la concentrazione di isoflurano secondo necessità.
- Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza oculare ed evitare possibili lesioni.
- Rimuovere i peli sulla sommità della testa con rasoio e crema depilatoria e lavare successivamente con acqua per rimuovere eventuali residui ed evitare irritazioni alla pelle.
- Per gli esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 μL di D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneale (i.p.) con una siringa da insulina da 29 G per la guida dell'immagine BLI.
- Inserire un catetere per vena caudale da 26-30 G e lavare il catetere e la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina (5 UI/mL). Riempire il catetere con una soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue.
nota: Un buon cateterismo si osserva quando c'è un reflusso di sangue nel catetere. Evitare bolle d'aria nel catetere per prevenire l'embolia. Per evitare un'eccessiva pressione di iniezione, assicurarsi che la lunghezza del catetere sia la più corta possibile.
- Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotassica a temperatura regolata per evitare l'ipotermia.
nota: L'ipotermia riduce la circolazione sanguigna, che può influenzare l'iniezione/circolazione di microbolle e la farmacocinetica dei farmaci.
- Immobilizza e fissa la testa dell'animale sulla piattaforma stereotassica utilizzando le barre auricolari e una barra per il morso. Fissa il corpo con una cinghia e fissa la coda dell'animale alla piattaforma.
3. Ultrasuoni focalizzati guidati da immagini in vivo
NOTA: Per questo protocollo è stato utilizzato un trasduttore monoelemento da 1 MHz con un impulso tone-burst con una durata di 10 ms, un MI di 0,4 e una frequenza di ripetizione dell'impulso di 1,6 Hz con 40 cicli per 240 s. Il protocollo è ottimizzato per microbolle stabilizzate da fosfolipidi contenenti esafluoruro di zolfo (SF6) come gas innocuo, per cui il diametro medio delle bolle è di 2,5 μm e oltre il 90% delle bolle è inferiore a 8 μm.
- Posizionare la piattaforma stereotassica con l'animale montato nella modalità di imaging (ad es. BLI o raggi X) e scattare l'immagine o le immagini dell'animale.
- Utilizzare i fiducial marker multimodali in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini per contrassegnare la posizione dell'animale in base al punto di messa a fuoco del trasduttore.
- Determinare l'area target posizionando un contorno cerebrale sull'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore (Figura 2). La posizione di parti specifiche del cervello è specificata nell'Atlante del cervello di Paxinos utilizzando i segni del cranio bregma e lambda come punti di riferimento. Ad esempio, il pons si trova x=-1.0, y=-0.8 e z=-4.5 da lambda.
- Proteggi le narici e la bocca dell'animale con del nastro adesivo per evitare che il gel per ultrasuoni interferisca con la respirazione.
- Applicare il gel per ultrasuoni sulla parte superiore della testa dell'animale.
- Ritrarre la pelle del collo degli animali, lubrificare l'ago idrofono con gel per ultrasuoni e posizionare l'ago idrofono nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale.
- Guidare il trasduttore nella posizione corretta utilizzando la pipeline di elaborazione delle immagini e il punto di messa a fuoco.
- Applicare le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati e scegliere come target la regione del cervello di interesse.
nota: A seconda della domanda di ricerca, le regioni tumorali o cerebrali possono essere sonoporate come un singolo punto focale o come forma volumetrica, come mostrato nella Figura 2.
- Attivare le microbolle come descritto dal produttore. Iniettare un bolo da 120 μl (5,4 μg) di microbolle.
- Lavare il catetere della vena caudale con soluzione fisiologica per controllare l'apertura del catetere.
- Iniettare le microbolle e avviare l'insonazione.
- Registra la cavitazione delle microbolle con l'idrofono ad ago.
- Somministrare un mezzo di contrasto intravascolare o un farmaco dopo la sonoporazione. La dose, i tempi e la pianificazione dipendono dallo scopo dello studio e dal farmaco.
nota: Il blu di Evans è un colorante comune per valutare l'apertura della BBB.
- Monitorare l'animale fino al momento predeterminato o prima del punto finale umanitario.
