Consegna genica basata sull'elettroporazione in utero: una tecnica per iniettare DNA plasmidico nelle cellule cerebellari embrionali di embrioni murini

Abstract

Fonte: Feng W. et al. Analisi della perdita di funzione mediata da CRISPR nelle cellule di granuli cerebellari utilizzando il trasferimento genico basato sull'elettroporazione in utero. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la consegna di DNA plasmidico nelle cellule neuronali cerebellari di embrioni murini utilizzando l'elettroporazione in utero. Questo metodo è utile per comprendere la funzione in vivo dei geni nel normale sviluppo cerebrale e i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule neuronali durante la progressione tumorale.

Protocollo

1. Esegui l'elettroporazione in utero

1. Alleva topi di età compresa tra 6 e 8 settimane e prepara gli strumenti per l'elettroporazione in utero. Incrociare topi maschi omozigoti Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP con topi femmina CD-1. Cronometrare la gravidanza dei topi CD-1 dal giorno in cui viene rilevato il tappo vaginale (E0.5). Gli embrioni vengono elettroporati al giorno E13.5.
   1. Estrarre i capillari in vetro borosilicato (diametro interno: 0,6–0,8 mm) con un estrattore per micropipette. Utilizzare le seguenti impostazioni: P = 500, Calore = 560, Tiro = 150, Vel = 75, Tempo = 250. Etichettare la punta capillare con inchiostro nero per una migliore visualizzazione durante l'iniezione. Tagliare la conicità capillare sotto uno stereomicroscopio utilizzando un righello e una pinzetta ad ago affilata e tagliare la punta a una lunghezza di circa 6 mm.
   2. Mantenere l'unità dei capillari per mantenere l'esperimento riproducibile. Create uno spigolo smussato unilaterale durante il ritaglio. La punta deve essere il più affilata possibile per facilitare la penetrazione della parete uterina e per evitare danni ai tessuti dell'embrione.
      nota: In alternativa, utilizzare un micro-grinder per regolare un angolo di 35°. I capillari possono essere conservati a temperatura ambiente in una capsula di Petri da 10 cm in condizioni prive di agenti patogeni.
   3. Autoclavare gli strumenti chirurgici.
   4. Miscelare i plasmidi sgRNA in parti uguali con pT2K-IRES-Luc fino a una concentrazione finale di almeno 1 μg/μL per ciascun plasmide e colorare la soluzione plasmidico con il verde veloce (concentrazione finale dello 0,05%). Preparare una soluzione madre verde rapida all'1% con acqua distillata priva di endotossine e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere le particelle di colorante dalla soluzione.
      nota: La co-trasfezione di pT2K IRES-Luc è opzionale, ma consente l'identificazione di animali vitali elettroporati dopo la nascita utilizzando l'imaging a bioluminescenza. Preparare una quantità sufficiente di miscela plasmidica per il numero totale di topi gravidi da operare. Utilizzare circa 15-20 μl di miscela per topo (~12 embrioni). Procedere immediatamente con l'intervento.
2. Preparare i topi per l'intervento chirurgico
   1. Anestetizzare topi CD-1 in gravidanza con isoflurano. Indurre l'anestesia in una scatola con isoflurano al 3-4% in volume (portata di ossigeno: 1,5 L/min) e mantenerla con il 2% in volume durante l'intervento chirurgico tramite il cono nasale.
      nota: L'intervento chirurgico completo non dovrebbe durare più di 30 minuti. Ridurre il numero di embrioni iniettati ed elettroporati, se necessario. Utilizzare guanti sterili per la chirurgia.
   2. Posiziona il mouse sul retro su un termoforo e regola l'anestesia.
   3. Iniettare analgesico (Metamizol, 800 mg/kg di peso corporeo, per via sottocutanea (s.c.), deposito 24 ore).
      nota: È possibile utilizzare altri analgesici autorizzati oltre al Metamizol.
   4. Applicare un unguento per prevenire la secchezza oculare durante l'intervento chirurgico.
   5. Fissare gli arti con del nastro adesivo e sterilizzare l'addome con un disinfettante. Coprire il topo con una garza, lasciando esposta solo l'area chirurgica. Distribuire etanolo al 70% sull'area chirurgica e sulla garza.
   6. Praticare un'incisione cutanea di circa 2 cm di lunghezza e allargare delicatamente lo spazio con le forbici chirurgiche dritte. Individuare la linea alba e praticare una seconda incisione leggermente più piccola attraverso il peritoneo utilizzando le forbici per fazzoletti con punta smussata.
   7. Inumidire la cavità addominale aperta con 1x PBS sterile preriscaldato.
   8. Estrarre con cautela le corna uterine dalla cavità addominale utilizzando una pinza ad anello. Tirare delicatamente afferrando la parete uterina solo nello spazio tra le sacche vitellino di due embrioni vicini. Evitare qualsiasi pressione sull'embrione mentre lo si tira attraverso l'incisione. Ingrandire l'incisione se necessario e prestare particolare attenzione a posizionare le corna uterine sull'addome senza comprimere il flusso sanguigno attraverso l'arteria uterina.
      nota: In alcuni casi, si consiglia di estrarre un corno uterino alla volta e sostituirlo prima di procedere con il secondo corno uterino.
3. Iniezione ed elettroporazione di DNA plasmidico
   1. Aspirare circa 15 μl di soluzione plasmidica colorata con il capillare di vetro preparato. Evitare bolle d'aria durante questo processo.
      nota: La soluzione plasmidico può ostruire facilmente la punta se la sua concentrazione è elevata. Testare il capillare rilasciando un po' di DNA subito prima dell'iniezione.
   2. Tenere delicatamente l'embrione con una pinza ad anello e individuare la zona del collo.
      nota: Se l'embrione si trova in una posizione difficile da iniettare, saltatelo e scegliete l'embrione successivo. Un maggiore riposizionamento dell'embrione può aumentare le possibilità di danneggiarlo.
   3. Perforare lentamente con la punta del capillare di vetro precedentemente preparato nel quarto ventricolo penetrando attraverso il rombencefalo dorsale e successivamente iniettare circa 1 μL della miscela plasmidica. Conferma che il DNA colorato non è trapelato dal cervello ed è visibile come una struttura a forma di diamante.
      nota: Come opzione, utilizzare lenti d'ingrandimento a 2,5 volte per una migliore visualizzazione del quarto ventricolo e dei vasi sanguigni circostanti. Erogare impulsi elettrici immediatamente dopo l'iniezione per prevenire la diffusione della soluzione plasmidica agli altri ventricoli.
   4. Applicare impulsi quadrati elettrici (5 impulsi, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) con pinzette di platino simili a pinze (vedi Tabella dei materiali). Posizionare gli elettrodi lateralmente con il polo negativo che copre l'orecchio e il polo positivo posizionato in corrispondenza del primordio cerebellare sopra la parete uterina. Utilizzare piastre per elettrodi di 5 mm di diametro per un'efficace elettroporazione degli embrioni E13.5.
      nota: Aumenta il tasso di sopravvivenza dei cuccioli manipolando^{meno di 2}/3 del numero totale di embrioni per madre. Evita gli embrioni troppo vicini alla cervice. Se manipolati, potrebbero causare complicazioni durante il travaglio e mettere a rischio l'intera cucciolata. Se gli elettrodi sono troppo vicini al cuore dell'embrione, ciò può causare l'arresto cardiaco.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nastro autoclave	Kisker Biotecnologie	150262
Electro Square Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	Codice 12362
etanolo	Merck	107017
Unguento per gli occhi (Bepanthen)	Bayer	81552983
Verde veloce	Merck	104022
Filtro (0,22 μm)	Merck	F8148
Pinze dritte	Strumenti per la scienza	91150-20
Garza (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientifico	15387311
Capillare in vetro con filamento	Narishige	GD1-2
termoforo	TermoLux	463265 / -67
Isoflurano	Zoetis	TU061219
Pinze ad anello	Strumenti per la scienza	Codice 11103-09
Stereomicroscopio	Nikon	C-PS
Forbici chirurgiche	Strumenti per la scienza	Codice: 91460-11
Forbici chirurgiche con punta smussata	Strumenti per la scienza	Codice: 14072-10
Pinzetta con elettrodi a disco da 5 mm Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Metamizol	Wdt
Filo di sutura in seta non sterile (0,12 mm)	Strumenti per la scienza	Codice: 18020-50
PBS (1x)	Tecnologie per la vita	14190169
Forbici per fazzoletti Blunt (11,5 cm)	Strumenti per la scienza	Codice: 14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	Codice: 50716
Plasmide pX330	Addgene	Numero 42230