Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei topi e chirurgia
NOTA: In questo studio vengono utilizzati topi C57BL/6J maschi e femmine di 8 settimane. Le condizioni chirurgiche seguono le regole IACUC della nostra istituzione. Gli strumenti vengono sterilizzati, la superficie di lavoro chirurgica viene disinfettata, l'animale viene disinfettato e il chirurgo indossa guanti sterili.
- Il giorno prima dell'intervento, anestetizzare il topo utilizzando isoflurano al 2% e quindi rimuovere il pelo lungo la lunghezza del femore sul lato dorsale con un rasoio sottile o un agente chimico per la depilazione.
- Il giorno dell'intervento, anestetizzare i topi utilizzando isofluorane al 2% in una camera di induzione. Confermare l'anestesia con uno stimolo di pizzicamento delle dita dei piedi e una mancanza di risposta.
- Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
- Posizionare il topo anestetizzato sul lato ventrale e fissare delicatamente ogni arto con nastro adesivo ipoallergenico per creare una leggera tensione nell'arto da iniettare. L'anestesia viene mantenuta utilizzando isoflurano erogato tramite un vaporizzatore di precisione e un cono nasale.
- Pulire il sito di iniezione con Betadine, quindi di nuovo con alcol al 70%. Ripeti questo processo altre due volte. Assicurarsi che non rimangano peli sciolti sul campo operatorio.
- Praticare un'incisione di 1 cm con delle forbicine circa 2 mm sotto e parallela al femore. Ritrarre la pelle con una pinza lateralmente per esporre i muscoli sottostanti.
- Il nervo sciatico corre in profondità fino ai muscoli del grande gluteo e del bicipite femorale. Separa questi due muscoli lungo un piano fasciale con piccole forbici ed esponi il nervo sciatico sottostante. Libera il nervo dai muscoli circostanti usando la dissezione smussata.
- Aspirare 3 μL di cellule tumorali (circa 50.000 cellule) dal pellet in una siringa da 10 μL.
nota: In alternativa, prelevare 3 μL di PBS come controllo.
- Posizionare una piccola spatola di metallo sotto il nervo nel punto di iniezione per sostenerla. Durante la visualizzazione con un microscopio da dissezione, inserire l'ago nel nervo contro la base metallica, mantenendo l'ago il più parallelo possibile al nervo al momento dell'inserimento. Fare attenzione a non perforare la parte posteriore del nervo. Riduci al minimo la manipolazione dei nervi il più possibile durante questo processo.
- Iniettare lentamente nel nervo per 5 s. La formazione di un bulbo nell'area di iniezione indica una buona iniezione. Quindi lasciare l'ago in posizione per 3 s prima di rimuoverlo delicatamente. Mantenendo l'ago in posizione per 3 secondi si riduce al minimo il riflusso delle cellule fuori dal nervo.
nota: L'iniezione può essere eseguita verso il nervo distale o il midollo spinale. È importante rimanere coerenti all'interno di una serie di esperimenti. Se le cellule fuoriescono all'esterno, l'animale non deve essere incluso nell'analisi dell'esperimento. Con l'esperienza, questi eventi sono molto rari.
- Riporta il nervo nella sua posizione originale. Copri il nervo con i muscoli sovrastanti. Trattare i topi con un'adeguata analgesia, quindi chiudere la pelle con suture di nylon 5-0.
- Metti il topo da solo in una gabbia pulita per l'osservazione durante il recupero, fino a quando non si risveglia completamente dall'anestesia.
nota: L'animale impiega 5-15 minuti per riprendere la piena coscienza. L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. L'animale non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Successivamente, valutare il recupero almeno una volta ogni 24 ore per 72 ore.
