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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Estrazione del nervo sciatico
- Prendi i topi i cui nervi sciatici sono stati precedentemente iniettati con cellule tumorali e sopprimili con CO2. Posiziona il mouse sul lato ventrale e stabilizza gli arti distali usando gli spilli.
- Rimuovere la pelle sul lato dorsale dell'arto e del busto iniettati.
- Usando la dissezione smussata, esporre il nervo sciatico in profondità nei muscoli.
- Il nervo scorre tra l'ileo e l'osso sacro. Per avere accesso al nervo nella regione del midollo spinale, separare le due ossa. Innanzitutto, inserisci le forbici chiuse nell'area stretta in cui si trova il nervo sciatico, quindi apri le forbici tenendo premuto il mouse. Sii delicato e mantieni l'integrità del nervo sciatico durante la dissezione.
- Sezionare con cura il nervo sciatico distalmente fino all'estremità del femore e prossimalmente al midollo spinale.
nota: I nervi invasi sono estremamente fragili e inclini a rompersi sotto tensione o manipolazione forzata.
- Raccogli il nervo tagliando prima la sua estremità distale. Sollevare con cautela il nervo liberandolo dal tessuto adiacente. Tagliare il nervo all'estremità prossimale, il più vicino possibile alla sua uscita dalla colonna vertebrale.
- Registrare quindi la lunghezza lorda dell'invasione utilizzando un calibro a corsoio. Questa stima macroscopica è solo indicativa.
2. Elaborazione e quantificazione dei nervi
- Incorporare il nervo sezionato nel composto OCT. Assicurati di posizionare i nervi longitudinalmente e il più piatto possibile sul fondo dello stampo.
- Indicare sulla cassetta il lato prossimale e distale del nervo contrassegnando le lettere P (Prossimale) e D (Distale).
- Posizionare i nervi incorporati sopra il ghiaccio secco, se non vengono sezionati immediatamente. Il campione può essere conservato a -80 °C per diverse settimane.
- Sezionare i campioni utilizzando un microtomo criostato a 5 μm di spessore e posizionare le sezioni su vetrini. Se possibile, inserire due sezioni nervose per vetrino. Indicare il lato prossimale del nervo.
- Colorare i vetrini utilizzando la colorazione H&E.
- Scansiona digitalmente le sezioni nervose colorate con uno scanner per vetrini che fornisce dati digitali ad alta risoluzione.
- Utilizzando il software di imaging, quantificare la durata dell'invasione facendo clic sul pulsante di misurazione della distanza, sull'area di invasione o su altri parametri desiderati. Per una buona stima della durata dell'invasione, utilizzare più sezioni (da 2 a 4) dello stesso nervo.