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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prepara i Topi per l'Iniezione di Cellule Tumorali
- Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di cocktail ketamina/xilazina (ketamina 100 mg/kg, xilazina 10 mg/kg).
- Confermare l'anestesia completa pizzicando le zampe dell'animale e osservare la mancanza di risposta.
- Posiziona il mouse su una lastra di vetro (utilizzata per la colata di gel proteici) e fissalo con elastici.
- Se necessario, rimuovere i peli del collo radendosi o applicando una piccola quantità di prodotto per la depilazione e asciugando i capelli con carta assorbente.
nota: Se usi topi nudi, salta questo passaggio poiché non hanno peli sul corpo.
- Pulisci la pelle del collo applicando iodio povidone e alcol al 70%.
- Posizionare il mouse sul tavolino del microscopio da dissezione
- Praticare un'incisione nella pelle lunga ~ 1 cm con un bisturi chirurgico.
- Sezionare senza mezzi termini il muscolo con una pinza dentata per esporre l'arteria carotide sottostante.
- Separare l'arteria carotide dal nervo vago adiacente con una pinza chirurgica.
- Usando una pinza chirurgica, separa un po' di cotone da un batuffolo di cotone, inumidisci e modella in un batuffolo di cotone più piccolo. Posizionare questo batuffolo di cotone idratato tampone sotto l'arteria carotide del sito di iniezione previsto.
- Posizionare una sutura distale e prossimale al batuffolo di cotone e fare dei nodi sciolti. Stringere il nodo prossimale per bloccare il flusso sanguigno nel sito di iniezione.
- Procedere all'iniezione di cellule tumorali se l'arteria carotide sul batuffolo di cotone appare completamente pressurizzata con sangue rosso fresco.
2. Iniezione di cellule tumorali nell'arteria carotide
- Agitare e aspirare 100 μL di cellule tumorali nella siringa.
- Sotto il microscopio da dissezione, inserire lentamente l'ago 31G (con lo smusso verso l'alto) nel lume dell'arteria carotide che si trova sopra il batuffolo di cotone.
- Iniettare lentamente le cellule dalla siringa nell'arteria carotide. Il successo dell'iniezione può essere osservato al microscopio dal cambiamento di colore dei vasi sanguigni e della muscolatura vicini quando le cellule tumorali tamponate vengono spinte nella circolazione.
- Quando l'iniezione dell'intero volume è completa, sollevare delicatamente l'arteria carotide distale per prevenire il rigurgito.
- Stringere rapidamente il nodo distale per completare il processo di iniezione.
- Dopo aver completato l'iniezione, stringere le legature e tagliare la sutura di seta in eccesso con micro-forbici al microscopio da dissezione. Spostare indietro il muscolo separato per coprire il sito della ferita. Chiudere la pelle con due graffette.
3. Recupero chirurgico
- Spostare l'animale azionato su un termoforo per il recupero. Potrebbero essere necessari 30-60 minuti prima che gli animali riprendano conoscenza. Nel frattempo, somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea come analgesia post-chirurgica.
nota: L'analgesia deve essere fornita secondo il protocollo locale approvato dall'IACUC.
- Una volta che gli animali si svegliano e riprendono il loro comportamento normale, riporta i topi al loro luogo di alloggio. Fornire ai topi cibo in gel per diversi giorni dopo l'intervento chirurgico. Mantenere una cartella clinica e conservarla nella stanza.
4. Imaging in vivo non invasivo
- Per le cellule marcate con costrutti reporter di luciferasi, misurare l'efficienza dell'iniezione delle cellule tumorali utilizzando il sistema di imaging in vivo.
nota: L'imaging non viene eseguito il giorno dell'iniezione per evitare uno stress eccessivo agli animali da ricerca.