Trapianto ortotopico a lungo termine di cellule tumorali in embrioni di zebrafish: un metodo efficiente per fornire cellule tumorali nel quarto ventricolo di embrioni di zebrafish per l'analisi a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Casey, M. J. et al. Trapianto di tumori cerebrali pediatrici di pesce zebra in ospiti immunocompetenti per lo studio a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali e della risposta ai farmaci.J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra il trapianto ortotopico di cellule tumorali cerebrali di zebrafish nel quarto ventricolo di un embrione di zebrafish immunocompetente. Questa procedura consente lo studio a lungo termine dell'invasione e del comportamento delle cellule tumorali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniettare la sospensione tumorale nel quarto ventricolo di un embrione 2-dpf

1. Trasferire 10-20 embrioni decorionati anestetizzati alla periferia della piastra di iniezione utilizzando una pipetta di trasferimento; gli embrioni devono cadere lateralmente sulla piastra di iniezione, con i ventricoli chiaramente visibili e accessibili. Utilizzare una sonda angolata per regolare gli embrioni secondo necessità e posizionarli lontano dal bordo esterno della piastra di iniezione.
2. Caricare 1-2 μl della sospensione di cellule tumorali nell'ago per iniezione utilizzando i puntali delle pipette di caricamento del gel e inserire l'ago nel manipolatore.
3. Abbassare manualmente il manipolatore, tenendo l'ago a un angolo di 45°. Regolare le manopole sul micromanipolatore nelle direzioni x, y e z fino a quando l'ago non si trova appena sopra e a circa 5 mm a destra della testa dell'embrione. Guarda attraverso gli oculari dello stereomicroscopio e regola lentamente il micromanipolatore in direzione x fino a quando l'ago non perfora il quarto ventricolo dell'embrione. Non permettere all'ago di perforare il cuore o il tuorlo.
   1. Premere il pedale collegato al microiniettore per iniettare la sospensione delle cellule tumorali.
      nota: La pressione e il tempo di iniezione variano in base alle dimensioni del foro dell'ago, ma un buon punto di partenza è 5-10 PSI e 50-100 ms. Il volume delle cellule tumorali iniettate può essere valutato con tecniche standard di goccia d'olio attraverso l'iniezione in olio minerale, se lo si desidera. Le iniezioni di 500 pL con un diametro della goccia di 0,1 mm danno in genere i migliori risultati.
4. Sciacquare delicatamente gli embrioni iniettati dalla piastra di iniezione e metterli in una capsula di Petri utilizzando acqua fresca d'uovo (0,6 g/L di sale d'acquario in acqua di osmosi inversa + 0,01 mg/L di blu di metilene). Mantenere gli embrioni in acqua d'uovo per le restanti procedure o fino a quando non vengono cresciuti in vasche.
5. Ispezionare gli embrioni iniettati con uno stereomicroscopio a fluorescenza. Verificare che la pressione di iniezione, l'angolo, le dimensioni dell'ago e la viscosità della sospensione cellulare portino le cellule tumorali a riempire il 25-50% dello spazio ventricolare. Regolare questi parametri in base alle esigenze.
6. Ripetere i passaggi 1.1-1.5 per tutti gli embrioni rimanenti. Anestetizzare gli embrioni aggiuntivi secondo necessità.
   nota: Un utente esperto può iniettare fino a 300 embrioni in 3-4 ore.
7. Rimettere gli embrioni nell'incubatrice a 28°C per una notte.
8. Il giorno successivo, valutare la sopravvivenza dell'embrione esaminando le caratteristiche morfologiche e fisiologiche, come il normale sviluppo del cuore e del cervello, come descritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acqua d'uovo	In casa		Mantenimento degli embrioni, realizzazione della piastra di iniezione
Petri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Alloggiamento degli embrioni, produzione di piastre per iniezione
Contenitore in vetro	Qualsiasi marchio commerciale		Realizzazione di piastre di iniezione
Micropipette	Qualsiasi marchio commerciale		Risospensione e trapianto tumorale
Sonda angolata	Strumenti per la scienza	Codice 10140-02	Manipolazione embrionale
Pipetta di trasferimento	Qualsiasi marchio commerciale		Manipolazione embrionale
Stereomicroscopio	Olimpo	SZ61	Trapianto di tumore
Stereomicroscopio fluorescente	Olimpo	SZX16	Imaging trapianti tumorali
Fotocamera per microscopio	Olimpo	DP-72	Imaging trapianti tumorali
incubatrice	Qualsiasi marchio commerciale		Mantenimento degli embrioni, riscaldamento della piastra di iniezione
N2	Qualsiasi marca commerciale		Per la configurazione del microiniettore
Capillare in vetro (senza filamento)	Strumenti di precisione mondiali	TW120-4	Trapianto di tumore
Estrattore dell'ago	Strumenti Sutter	P-97	Trapianto di tumore
Punte per microloader	Eppendorf	930001007	Trapianto di tumore
Microiniettore	Apparato di Harvard	PLI-90	Trapianto di tumore
Tricaina-S (MS-222)	Chimica occidentale	TRS1	Trapianto di tumori, anestetico
agarosio	Denville	CA3510-8	Realizzazione di piastre di iniezione
microonde	Qualsiasi marchio commerciale		Realizzazione di piastre di iniezione
scala	Qualsiasi marchio commerciale		Realizzazione di piastre di iniezione
guanti	Qualsiasi marchio commerciale		Tutti gli aspetti del protocollo
Pronasi	Roche Diagnostics	11459643001	Embrioni decoronati
lametta	Thermo Fisher	Codice 12640	Preparazione dell'ago
Bicchiere da 50 ml (diametro 2 pollici)	Qualsiasi marchio commerciale		Realizzazione di piastre di iniezione
Contenitore in vetro	Qualsiasi marchio commerciale		Realizzazione di piastre di iniezione
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M9140	Aggiungere all'acqua d'uovo per prevenire la crescita di funghi