Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Precondizionamento ipossico delle NSC umane (Figura 1A)
- NSC coltivate su piastra in fiasche di coltura T75 fino al raggiungimento della confluenza del 90%.
- Posizionare i palloni per colture cellulari all'interno di una camera/incubatore umidificato con livelli di O2 dell'1% mantenuti per 24 ore, tramite alimentazione di gas N2 controllata da un flussometro integrato automatizzato. Queste cellule sono indicate come NSC H. Le NSC Ndi controllo sono generate come:
- Mantenere le NSC umane (clone HB1.F3.CD) in terreno DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 95% di aria ambiente e il 5% di CO2.
2. Caricamento di NSC umani con virus oncolitico (Figura 1B-1H)
- Infettare le NSC N, le NSC Hcon 50 particelle virali di adenovirus replicativo condizionale (CRAd)-S-pk7/cellula.
- Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente con picchiettamento periodico, lavare le cellule tre volte con terreno per rimuovere le particelle virali non legate e sospendere le cellule in soluzione fisiologica sterile per l'iniezione.
cautela: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in vitro correlate al virus in strutture con l'appropriata designazione del livello di biosicurezza, come BSL2. I ricercatori che gestiscono il virus oncolitico devono indossare adeguati dispositivi di protezione individuale secondo le linee guida istituzionali della struttura per animali.
3. Somministrazione intranasale di NSC terapeutiche (Figure 1D e Figura 2D)
- Coltivare e raccogliere NSC (NNSC, HNSC).
- Anestetizzare i topi tramite iniezione i.p. di una miscela di ketamina e xilazina secondo la procedura:
- Anestetizzare l'animale in base al peso corporeo utilizzando i reagenti approvati, ad esempio, tramite un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (50-100 mg/kg; consultare l'IACUC istituzionale per l'intervallo di dosaggio approvato) e xilazina (5-10 mg/kg; consultare l'IACUC istituzionale per l'intervallo di dosaggio approvato) in 200-250 μL di soluzione fisiologica sterile, o tramite anestesia con isoflurano al 4-5% utilizzando un dispositivo inalatorio.
- Posiziona i topi su un telo pulito rivolto verso l'alto con un termoforo sottostante per mantenere la temperatura corporea. Regola un cuscino imbottito fatto di tovaglioli di carta arrotolati con nastri adesivi per garantire l'angolo verticale delle narici quando viene posizionato sotto la testa del mouse.
- Utilizzando una micropipetta, erogare 2 μL di sospensione di NSC in ciascuna narice del topo. Confermare visivamente l'aspirazione della gocciolina prima di passare al mouse successivo. Il numero totale di celle erogate può essere determinato dall'utente; utilizzare 62.500-125.000 cellule/μL, in modo tale da poter erogare 0,5-1 milione di cellule in dosi da 4 x 2 μL.
- Utilizzare un timer per garantire intervalli di 5 minuti tra ogni somministrazione di sospensione cellulare, fino a 4 volte.
- Consentire agli animali di riacquistare la mobilità in una camera di recupero, mantenendo la posizione supina per tutto il tempo.
