Generazione di microtumori: una tecnica di coltura in vitro per la coltura di microtumori 3D per analizzare la risposta al trattamento farmacologico

Abstract

Fonte: Gilbert, A. N. et al. Generazione di microtumori utilizzando il sistema di coltura 3D Human Biogel e cellule di glioblastoma derivate da pazienti per la profilazione cinemica e i test di risposta ai farmaci. J. Vis. Exp. (2016)

In questo video, generiamo microtumori da cellule tumorali derivate da pazienti utilizzando biogel umano 3D. Questi microtumori assomigliano molto al microambiente tumorale in vivo e fungono da potenziali piattaforme per la sperimentazione di farmaci.

Protocollo

1. Generazione di microtumori

1. Preparazione dei reagenti
   1. Preparare l'NBM completo aggiungendo quanto segue a un flacone da 500 ml di Neurobasal Media (NBM) per preparare l'NBM completo: 10 ml di integratore B-27 senza vitamina A, 5 ml di integratore di N2, 100 μl di EGF, 100 μl di fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)-basico, 5 ml di amfotericina B, 0,5 ml di gentamicina, 5 ml di L-glutammina e preparare il biogel umano ad alta densità neutralizzato (HuBiogel) (HDHG a 3 mg/mL) secondo il protocollo interno. Possono essere utilizzate anche matrici di biogel simili.
2. Produzione e coltura di microtumori
   1. Ottenere cellule PDX appena dissociate come sospensione a cellula singola in NBM completo, su ghiaccio.
   2. Miscelare la sospensione cellulare con un volume uguale di soluzione di blu di tripano (0,4% in PBS) e analizzare utilizzando l'emocitometro per determinare il numero e la vitalità delle cellule mediante esclusione del blu di tripano. Rimuovere il volume necessario per generare 50.000 cellule/microtumore dove volume = (50.000 cellule/tumore * # tumori)/(conta delle cellule vitali / 1 mL) e inserire in una nuova provetta conica.
   3. Concentrare le celle mediante centrifugazione a 150 x g, per 8 min, a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con una soluzione di HDHG ghiacciata in un rapporto finale di 1 parte di celle in FBS e 4 parti di HDHG.
   4. Utilizzare una pipetta elettronica multicanale per erogare 10 μl per miscela di pile a perno-HDHG su una piastra di acciaio a 96 pin (con rivestimento idrofobico) per generare microtumori (perline da 2 mm contenenti ciascuna 50.000 cellule).
   5. Posizionare le perle tumorali 3D all'interno dell'incubatore per colture tissutali (37 °C, 5% CO₂, umidificato) per 15 minuti per gelificare le perline.
   6. Dopo la gelificazione, trasferire i microtumori (10 μL) in una camera di coltura in sospensione personalizzata (50 mL) o in una piastra di coltura di grande volume (10 cm) contenente NBM completo utilizzando la pipetta elettronica multicanale e il dispositivo a spillo personalizzato.
   7. Dopo 1-2 giorni nell'incubatore per colture tissutali, trasferire i microtumori in piastre di coltura a 96 pozzetti contenenti 50 μL di NBM/pozzetto utilizzando una pipetta di dispensazione a bocca larga ed eseguire vari protocolli di analisi e analisi.
3. Trattamento farmacologico e mantenimento dei microtumori
   1. Selezionare le concentrazioni finali per i test antidroga.
      NOTA: Se il farmaco ha un'efficacia nota nella coltura 2D, selezionare 2 volte l'IC50 come concentrazione di dose media e selezionare diluizioni seriali di 3 volte sopra e sotto per un totale di 5 livelli di dose. Ad esempio, se l'IC50 è 9 μM per il farmaco in coltura 2D, selezionare 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM e 162 μM come concentrazione finale per il test del farmaco.
   2. Preparare 2 soluzioni di dosaggio del farmaco in NBM completo da stock di dimetilsolfossido (DMSO). Diluire la soluzione di dosaggio in terreno DMSO all'1% per preparare una diluizione seriale di 5 dosi e 3 volte.
   3. Aggiungere 50 μl di soluzione di dosaggio al pozzetto del microtumore contenente 50 μl nelle piastre del saggio per ottenere una concentrazione finale di DMSO dello 0,5%. Ripetere per ogni replica (ad es. 4) ad ogni dose di farmaco determinata al punto 1.3.1.
   4. Mantenere le colture in un incubatore per colture tissutali umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 1-14 giorni. Nutrire le colture due volte alla settimana rinfrescando il terreno e la soluzione farmacologica come sopra.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi-I	Sigma-Aldrich	CO130
Neurobasale-A	Tecnologie per la vita	Codice 10888-022
Supplemento N-2	Tecnologie per la vita	Codice 17502-048	1x concentrazione finale
Integratore di B-27 senza vitamina A	Tecnologie per la vita	Codice 12587-010	1x concentrazione finale
FGF-basico umano ricombinante	Tecnologie per la vita	PHG0266	Concentrazione finale di 10 ng/mL
L-Glutammina	Corning Cellgro Mediatech	25-005-CI	Concentrazione finale di 2 mM
Gentamicina	Tecnologie per la vita	Codice 15750-060	Concentrazione finale di 50 ng/mL
Tripan Blu	Pierce ThermoScientific	Codice 15250-061
Hubiogel ad alta densità	Vivo Bioscienze	HDHG-5
Dmso	pescatore	BP231	Per la dissoluzione della calceina AM e dei composti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco con Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	Diluito a 1x con acqua ultrapura MiliQ (per il lavaggio pre-fissaggio)
10% formalina tamponata neutra	protocollo	Codice 032-060
Piastre Petri in vetro da 100 mm	pescatore	08-748D