Induzione del glioblastoma mediante trasposizione mediata da SB: una tecnica per generare un nuovo modello murino utilizzando l'integrazione mediata da trasposoni del plasmide SB nel cervello di topo neonatale

Abstract

Fonte: Calinescu, A. A. et al. Integrazione mediata dal trasposone del DNA plasmidico nella zona subventricolare di topi neonatali per generare nuovi modelli di glioblastoma. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video descrive una tecnica efficace per indurre glioblastomi (GBM) utilizzando il DNA trasposone iniettato nei ventricoli di topi neonati. Le cellule della zona subventricolare, che assorbono il plasmide, trasformano, proliferano e generano tumori con caratteristiche istopatologiche del GBM umano.

Protocollo

1. Iniezioni neonatali intraventricolari

1. Tre o quattro settimane prima dell'esperimento, allestisci una gabbia per l'allevamento dei topi con un maschio e una femmina e un igloo colorato di plastica. Ciò fornisce un ambiente arricchito e aiuta nel processo di accoppiamento.
2. Quando la gravidanza è confermata, portare il maschio in una nuova gabbia. Diciotto giorni dopo l'accoppiamento, monitorare quotidianamente la gabbia per il parto. Eseguire iniezioni intraventricolari il giorno 1 postnatale (P1).
3. Preparazione della soluzione iniettabile.
   NOTA: La soluzione di iniezione viene prodotta mescolando il DNA plasmidico con il reagente di trasfezione per creare le particelle per la trasfezione. Di seguito è riportato un esempio sulla preparazione di una soluzione iniettabile utilizzando un plasmide codificante la trasposasi della Bella Addormentata e la luciferasi: pT2/SB100x-Luc e due plasmidi trasposoni: pT/CAGGS-NRASV12 e pT/CMV-SV40-LgT, con un rapporto di 1:2:2. Tutti i plasmidi hanno una concentrazione di 2 μg/μL.
   1. Preparare la soluzione di DNA aggiungendo: 4 μg (2 μL) di pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μL) di pT/CAGGS-NRASV12 e 8 μg (4 μL) di pT/CMV-SV40-LgT e 10 μL di glucosio al 10% a un volume finale di 20 μL a una concentrazione di 1 μg/mL di DNA e 5% di glucosio.
   2. Preparare la soluzione di PEI aggiungendo 2,8 μL di PEI jet in vivo, 7,2 μL di acqua sterile e 10 μL di glucosio al 10% a una concentrazione finale di glucosio del 5%.
   3. Aggiungere la soluzione di PEI alla soluzione di DNA, mescolare e agitare e lasciare riposare a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti. La soluzione è ora pronta per l'iniezione. Dopo un'ora a RT, mantenere la soluzione in ghiaccio.
   4. Inserire nella micropompa una siringa pulita da 10 μl dotata di un ago ipodermico da 30 G con smusso di 12,5° (Figura 1 #1).
4. Per verificare il corretto funzionamento del sistema di iniezione, utilizzare l'iniettore automatico (Figura 1 #1) per prelevare 10 μL di acqua nella siringa, quindi svuotare completamente la siringa.
5. Raffreddare lo stadio stereotassico neonatale (Figura 1 #3) con un impasto di ghiaccio secco e alcol a una temperatura di 2-8°C.
6. Indurre l'anestesia posizionando i cuccioli su ghiaccio umido per 2 minuti. L'anestesia continuerà sul telaio stereotassico raffreddato per il resto della procedura. Mantenere la temperatura del telaio sopra lo zero, tra 2 e 8 °C, eviterà ustioni termiche. Come precauzione speciale, i cuccioli possono essere avvolti in una garza prima di metterli sul ghiaccio bagnato.
7. Riempia la siringa con la soluzione di DNA/PEI.
8. Immobilizzare il cucciolo nel telaio stereotassico posizionando la testa tra le barre auricolari ricoperte di garza (Figura 1b). Assicurarsi che il lato dorsale del cranio sia orizzontale, parallelo alla superficie del telaio e che le suture craniche siano chiaramente visibili. Pulisci la testina con etanolo al 70%.
9. Abbassare l'ago della siringa e regolare le coordinate stereotassiche utilizzando i quadranti del telaio stereotassico fino a quando l'ago tocca la lambda (l'intersezione della linea mediana delle ossa parietale e occipitale) (Figura 1b).
10. Sollevare l'ago e regolare le coordinate stereotassiche a 0,8 mm lateralmente e 1,5 mm rostrali alla lambda (Figura 1b).
11. Abbassare l'ago fino a toccare e increspare leggermente la pelle. Misura le coordinate. Abbassare l'ago di altri 1,5 mm. L'ago perfora la pelle e il cranio e passa attraverso la corteccia per entrare nel ventricolo laterale (Figura 1c).
12. Utilizzando l'iniettore automatico, iniettare 0,75 μL della soluzione DNA/PEI a una velocità di 0,5 μL/min.
13. Tieni il cucciolo sul telaio per un altro minuto per consentire alla soluzione di disperdersi nei ventricoli. Nel frattempo, anestetizzare un altro cucciolo, sul ghiaccio per 2 minuti in preparazione per l'iniezione successiva.
14. Solleva delicatamente e lentamente l'ago e posiziona il cucciolo sotto una lampada riscaldante. Monitora la respirazione e l'attività. Se necessario, fornire una leggera stimolazione degli arti fino alla prima respirazione.
15. Restituisci il cucciolo alla madre dopo che si è riscaldato, ha raggiunto un colore rosato, respira regolarmente ed è attivo, normalmente 5-7 minuti. Se viene iniettato più di un cucciolo alla volta, tenere tutti i cuccioli insieme fino a quando tutte le iniezioni sono state eseguite. Se le iniezioni durano più di 30 minuti, restituire metà dei cuccioli dopo i primi 30 minuti e il resto alla fine della procedura.
16. Monitora che la madre sia reattiva e premurosa per i suoi cuccioli. Se necessario, aggiungi una mamma surrogata alla gabbia.
17. Assicurarsi che l'intervallo tra il posizionamento del cucciolo sul ghiaccio e il posizionamento sotto il riscaldamento lamp è inferiore a 10 minuti. Più veloce è la procedura, migliore è la sopravvivenza. Di solito, il tempo necessario per anestetizzare e iniettare un cucciolo è di 4 minuti.

Risultati

Figura 1: Configurazione sperimentale e guide per iniezioni intra-ventricolari in topi neonatali. (a)Un telaio stereotassico (2) con quadranti micrometrici è dotato di un iniettore automatico che contiene una siringa da 10 μl (4). All'interno del telaio a U, un telaio adattatore neonatale è fissato saldamente (3). Il pannello di controllo dell'iniettore automatico (1) consente una se...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stoelting's Lab Standard con adattatori per ratti e topi	Stoelting	Codice: 51670	Altre aziende producono telai simili, ognuno di essi con piccoli adattatori per mouse è adatto
Iniettore stereotassico per eccellenza (QSI)	Stoelting	Codice: 53311	Le iniezioni possono essere effettuate senza di esso, ma l'iniettore automatico consente una maggiore riproducibilità e praticità
Siringa MICROLITER da 10 μl serie 700	Hamilton	Modello 701	Questo modello di siringa erogherà in modo affidabile da 0,5 a 500 μL di soluzione. Possono essere utilizzate anche altre siringhe (ad esempio 5 μL, modello 75)
Ago ipodermico calibro 30 (1,25", 15^{o} smusso)	Hamilton	S/O# 197462	Questo ago è ideale per perforare la pelle e il cranio di un topo neonatale senza la necessità di altre procedure invasive. Se diventa opaco (non entra facilmente nella pelle), deve essere sostituito.
Getto in vivo PEI	Trasfezione Polyplus	201-10G	Aliquotare in piccoli volumi e conservare a -20ºC
D-luciferina, sale di potassio	Goldbio.com	FortunaK-1g	Altre fonti di lucciola lucifierase sono altrettanto adeguate
Soluzione di ematossilina, Harris modificata	Sigma Aldrich	HHS128-4L