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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione
NOTA: Le condizioni sterili non sono richieste a meno che non vengano utilizzati recipienti per scopi di coltura cellulare. Preparare le soluzioni del recipiente di isolamento: B1, aggiungere 1,5 mL di HEPES 1M a 150 mL di HBSS; B2, aggiungere 3,6 g di destrano a 20 ml di B1; B3, aggiungere 1 g di BSA a 100 ml di B1.
- Preparare un becher da 150 ml con 20 ml di B1. Tenere sul ghiaccio e coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell'aria.
- Anestetizzare profondamente il topo sotto una cappa con un piccolo tovagliolo di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano puro che viene aggiunto nella gabbia. L'anestesia è verificata dalla mancanza di reazione a un pizzico di dito del piede. Uccidi il topo per lussazione cervicale.
nota: Questi passaggi vengono eseguiti nel rispetto delle normative nazionali e istituzionali.
- Opzionale: Eseguire la perfusione intracardiaca con 20 ml di PBS 1x per eliminare il contenuto di sangue.
- Sezionare la pelle con un bisturi dal collo al naso e tirarla via. Rimuovi tutti i peli contaminanti con PBS 1x.
- Per aprire il cranio, per prima cosa, inserire le forbici anteriormente al bulbo olfattivo e aprire le forbici per rompere il cranio in due parti.
- Rimuovere con cautela il cervello usando una spatola cerebrale. Sezionare il plesso coroideo dai ventricoli laterali in quanto contaminerebbero la preparazione dei vasi sanguigni.
nota: Facoltativo: la preparazione finale conterrà vasi parenchimali e meningi. Se non lo si desidera, le meningi possono essere staccate.
- Trasferisci il cervello nel becher contenente una soluzione di B1 su ghiaccio. È possibile trattare fino a 8 cervelli insieme.
2. Omogeneizzazione del tessuto cerebrale
- Utilizzando due bisturi, battere manualmente e vigorosamente il cervello nella soluzione B1 ottenendo successivamente piccoli pezzi di circa 2 mm.
- Omogeneizzare la preparazione con un omogeneizzatore Dounce automatizzato, eseguendo 20 colpi a 400 giri/min. Assicurarsi che il tubo di vetro sia mantenuto nel ghiaccio e che la parte superiore del douncer sia in soluzione durante lo spostamento su e giù, in modo da evitare la formazione di sacche d'aria. Se vengono preparati più campioni, lavare il douncer con acqua ionizzata tra ogni omogeneizzazione.
3. Purificazione del vaso
- Trasferire l'omogeneizzato in una provetta di plastica da 50 mL e procedere alla centrifugazione a 2.000 x g per 10 min a 4 °C. Una grande interfaccia bianca (principalmente mielina) si formerà sulla parte superiore del pellet del vaso (rossa se non è stata eseguita alcuna perfusione).
- Scartare il surnatante. Il pellet del recipiente e l'interfaccia bianca rimarranno attaccati insieme. Aggiungere 20 ml di soluzione ghiacciata di B2 e agitare la provetta manualmente e vigorosamente per 1 minuto.
- Procedere alla seconda centrifugazione a 4,400 x g per 15 min a 4 °C. La mielina formerà ora un denso strato bianco sulla superficie del surnatante.
- Staccare con cautela lo strato di mielina dalle pareti del tubo tenendo il tubo e ruotandolo lentamente per consentire al surnatante di passare lungo le pareti. Eliminare la mielina con il surnatante. Il pellet contenente i recipienti rimane attaccato sul fondo del tubo.
- Tamponare la parete interna della provetta con carta assorbente avvolta attorno a una pipetta di plastica da 5 ml e rimuovere tutti i liquidi residui, evitando di toccare il pellet del recipiente. Tenere il tubo capovolto su carta assorbente per drenare il liquido residuo.
- Sospendi il pellet in 1 mL di soluzione B3 ghiacciata pipettando su e giù con puntali a basso legame, mantenendo la provetta sul ghiaccio, quindi aggiungi altri 5 mL di soluzione B3. Assicurarsi che i vasi siano dispersi il più possibile e non formino aggregati.
4. Filtrazione
- Preparare un becher con ghiaccio con 30 ml di soluzione B3 ghiacciata. Coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell'aria.
- Posizionare un filtro da 20 μm su un portafiltro modificato sulla parte superiore di un pallone Becker ed equilibrare applicando 10 mL di soluzione B3 ghiacciata.
- Versare il preparato del recipiente sul filtro e sciacquare i recipienti con 40 ml di soluzione B3 ghiacciata.
- Recuperare il filtro con una pinza pulita e immergerlo immediatamente nel becher contenente la soluzione B3. Staccare i recipienti dal filtro agitandolo delicatamente.
- Versare il contenuto del becher in una provetta di plastica da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti a 4°C.
nota: In alternativa, la sospensione dei vasi cerebrali dal passaggio 3.6 può essere filtrata su un filtro a maglie da 100 μm. In questo caso, i recipienti più grandi vengono trattenuti preferenzialmente sul filtro, mentre il flusso contiene microvasi (principalmente capillari), che vengono poi filtrati su un filtro a maglie di 20 μm come sopra.
- Risospendere il pellet di microrecipienti in 1 mL di soluzione B3 ghiacciata e trasferirlo pipettandolo in una provetta Eppendorf da 1,5 mL. Centrifugare a 2.000 x g per 5 min a 4 °C.