Saggio di fagocitosi in vitro: un metodo basato sull'imaging dal vivo per studiare la fagocitosi sinaptosomica mediata da astrociti in tempo reale

Abstract

Fonte: Byun, Y. G., Chung, W. S. Un nuovo test di imaging in vitro dal vivo della fagocitosi mediata da astrociti utilizzando sinaptosomi coniugati con indicatore di pH. J. Vis. (2018)

In questo video, valutiamo la capacità fagocitaria di astrociti purificati in vitro mediante test di imaging dal vivo. Il test funge da efficace piattaforma di screening per identificare i composti chimici che possono migliorare o inibire la capacità fagocitaria degli astrociti.

Protocollo

1. Saggio di imaging dal vivo per fagocitosi (Figura 1)

1. Preparare una piastra a 24 pozzetti (o qualsiasi piastra/piastra preparata per l'imaging dal vivo) in cui gli astrociti siano confluenti (generalmente, da 7 a 10 giorni di incubazione dopo la purificazione è l'ideale per stabilizzare le cellule).
2. Rimuovere il terreno in ogni pozzetto e lavare i pozzetti con 1 mL di soluzione salina tampone fosfato di Dulbco (DPBS), tre volte. Per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, lavare rapidamente i pozzetti.
3. Aggiungere 300 μL di terreno basico per astrociti immunopannati (IP-ABM) con 5 μL di sinaptosomi coniugati con indicatore di pH e fattori aggiuntivi come i terreni condizionati con astrociti immunopannati (IP-ACM) che possono modulare la fagocitosi delle cellule gliali.
4. Incubare la piastra in un incubatore di CO₂ per 40 minuti. Questo passaggio consente ai sinaptosomi coniugati con indicatore di pH di depositarsi sul fondo delle piastre.
5. Rimuovere il terreno con sinaptosomi coniugati con indicatore di pH non legato e lavare ogni pozzetto con 1 mL di DPBS, tre volte.
   cautela: Non lavare con forza. Per ridurre al minimo l'esposizione all'aria, lavare rapidamente i pozzetti.
6. Aggiungere 500 μl di IP-ABM con fattori aggiuntivi da testare nei pozzetti.
7. Portare la lastra a uno strumento di imaging dal vivo e selezionare le posizioni. Regola la messa a fuoco, il tempo di esposizione, la luminosità e la potenza del LED.
   nota: Le impostazioni per il tempo di esposizione, la luminosità e la potenza del LED variano a seconda dell'intensità della fluorescenza e dello scopo dell'esperimento. Nel saggio di imaging dal vivo con sinaptosomi coniugati con indicatore di pH, di solito impostiamo questi valori come segue: esposizione: ~150-200 ms, luminosità: 15 e potenza LED: 4-6.
8. Imposta il formato dell'immagine, l'intervallo di tempo e il numero totale di cicli per l'imaging dal vivo. Impostare l'intervallo di tempo su 1 o 2 ore a seconda del numero di posizioni selezionate. Si consigliano intervalli di 2 ore quando vengono selezionate più di 150 posizioni per l'imaging dal vivo.
9. Inizia gli esperimenti di imaging dal vivo.

Risultati

Figura 1. Schema del test di imaging dal vivo della fagocitosi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
rosso di pHrodo, estere succinimidilico	Sonde Molecula	P36600	Per la coniugazione dell'indicatore di pH
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	Codice 16000-044
DMEM	Gibco	Codice 11960-044
dPBS	Welgene	LB001-02
Test di imaging in tempo reale per fagocitosi
Tappa Juli	NanoEntek
Plugin di Time Series Analyzer V3	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html